The role of endogenous H2S in experimental metabolic syndrome

Julia G. Birulina; Бирулина Ю. Г.; Vladimir V. Ivanov; Иванов В. В.; Evgeny E. Buyko; Буйко Е. Е.; Olga V. Voronkova; Воронкова О. В.; Nikita A. Chernyshov; Чернышов Н. А.; Svetlana V. Gusakova; Гусакова С. В.

doi:10.22363/2313-0245-2024-28-3-331-339

The role of endogenous H2S in experimental metabolic syndrome

Authors: Birulina J.G.¹, Ivanov V.V.¹, Buyko E.E.¹, Voronkova O.V.¹, Chernyshov N.A.¹, Gusakova S.V.¹
Affiliations:
1. Siberian State Medical University
Issue: Vol 28, No 3 (2024): PHYSIOLOGY. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY
Pages: 331-339
Section: PHYSIOLOGY. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY
URL: https://journals.rudn.ru/medicine/article/view/40853
DOI: https://doi.org/10.22363/2313-0245-2024-28-3-331-339
EDN: https://elibrary.ru/AFKRGE
ID: 40853

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Relevance. The gasotransmitter hydrogen sulphide (H₂S) is a well-known signalling molecule that is involved in the regulation of a wide range of cellular functions in both health and disease. Its biological effects in obesity and metabolic syndrome (MetS) have been investigated. It is a promising pharmacological target for the correction of MetS and associated diseases. The aim of this study is to investigate the role of endogenously produced H₂S in the pathogenesis of metabolic disorders in experimental Met S. Materials and Methods. A high-fat and high-carbohydrate diet was used to induce MS in male Wistar rats. The body and adipose tissue weights of the animals were determined. The animals body and adipose tissue weights were measured. Indicators of carbohydrate and lipid metabolism in the blood serum were determined with the use of reagent kits. Additionally, the levels of reactive oxygen species (ROS) and reduced glutathione (GSH) were analyzed in adipose tissue through photometric analysis. The concentration of H₂S in blood serum and adipose tissue, as well as H₂S production by adipocytes, was measured spectrophotometrically. Results and Discussion. H₂S concentrations in blood serum, adipose tissue and adipocyte H₂S production were found to decrease in animals with hyperglycaemia and insulin resistance. Additionally, a negative correlation was observed between the H₂S content and production in the adipose tissue of rats with the mass of visceral adipose tissue. Furthermore, a negative relationship was found between the concentrations of glucose, insulin, leptin, ROS and the level of H₂S in blood serum and adipose tissue. In contrast, the increase in glutathione (GSH) in adipocytes was directly correlated with the increase in hydrogen sulfide (H₂S) in serum and adipose tissue cells. Conclusions. The regulatory effect of H₂S on target cell function has been extensively studied. However, its role in the development and progression of MetS remains unclear. Our work demonstrates that under conditions of metabolic pathology, there is a decrease in the serum concentration of H2S and its production in adipose tissue. This decrease correlates with the development of obesity, hyperglycemia, insulinemia, leptinemia, and redox imbalance.

Keywords

hydrogen sulfide, metabolic syndrome, obesity, hyperglycemia, insulin resistance

Full Text

Введение

Газотрансмиттеры представляют собой небольшие молекулы эндогенного газа, которые обладают способностью диффундировать в клетки для взаимодействия со своими мишенями и индуцировать ряд внутриклеточных реакций сигнальной трансдукции [1, 2]. Ввиду высокой растворимости в липидах для проникновения через клеточные мембраны газотрансмиттерам не требуется взаимодействие с рецепторами плазматической мембраны, равно как и участие специального переносчика для передачи сигнала.

Сероводород (H₂S), наряду с оксидом азота (NO) и оксидом углерода (CO), также принадлежит к семейству газомедиаторов [3]. Несмотря на то, что H₂S был ранее известен как токсичный газ, многочисленные экспериментальные исследования показывают, что он производится ферментативно во многих клетках организма млекопитающих и человека, а также опосредует ряд таких физиологических функций, как регуляция сосудистого тонуса, ангиогенез [4], нейротрансмиссия [5], продукция инсулина [6], апоптоз, воспалительная реакция [7] и др. Показано, что свои эффекты H₂S реализует через широкий спектр сигнальных молекул, реагируя с супероксид-анионом, перекисью водорода, пероксинитритом, тиоловыми производными и NO, воздействует на различные транскрипционные факторы (Nrf2, FoxO3, NF-kB) [8, 9], а также ионные каналы [4] в клетках-мишенях.

В то же время в литературе имеются сведения о том, что при различных патологических состояниях, ассоциированных с нарушением обмена веществ, таких как сахарный диабет, ожирение, метаболический синдром (МС), происходит нарушение продукции и снижение биодоступности H₂S [10, 11]. Метаболические и гемодинамические нарушения, возникающие при МС, вероятно, оказывают влияние на баланс данного газомедиатора и механизмы его воздействия. Противоречивость данных об эффекторном потенциале H₂S при МС, а также ассоциированных с ним социально-значимых заболеваний, делает его перспективным объектом для исследований. Существующие на сегодняшний день сведения о влиянии H₂S на клеточный гомеостаз позволяют рассматривать его в качестве возможного претендента на роль протекторного биологического агента.

Таким образом, целью исследования явилось изучение роли эндогенно продуцируемого H₂S в патогенезе метаболических нарушений при экспериментальном МС.

Материал и методы

Для исследований было выполнено моделирование МС в эксперименте на крысах-самцах Wistar (25 самцов, возраст на начало исследования 6 недель) по ранее описанной методике [12]. Протокол исследования был одобрен Комиссией по контролю содержания и использования лабораторных животных (IACUC) ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (протокол № 1 от 25.04.2022 г.). Крысы контрольной группы получали стандартный корм («Чара», Ассортимент-Агро, РФ). Крысы опытной группы в течение 12 недель находились на высокожировой и высокоуглеводной диете (ВЖВУД) с заменой питьевой воды на 20 % раствор фруктозы. Животных выводили из эксперимента СО₂-эвтаназией. Выполняли забор крови из сердца, которую затем центрифугировали (2000 g, 10 мин) для получения сыворотки. Извлекали и взвешивали висцеральную жировую ткань. В сыворотке крови определяли концентрацию глюкозы (Glucose-TR, Chronolab, Испания), инсулина (Insulin Rat ELISA Kit, Thermo Fisher Scientifiс, США), лептина (Rat Leptin ELISA Kit, ELK Biotechnology, КНР). Рассчитывали индекс HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance) по формуле: (сывороточный инсулин) × (сывороточная глюкоза)/22,5.

Концентрацию H₂S в сыворотке крови определяли по методике Li L. и соавт. [13], для чего аликвоты сыворотки смешивали с дистиллированной водой, ацетатом цинка (1 % масс./об.), трихлоруксусной кислотой (10 % масс./об.), N, N-диметил-п-фенилендиаминсульфат (20 мкмоль/л) и FeCl₃ (30 мкмоль/л) в 7,2 М HCl. Через 15 мин измеряли оптическую плотность при 670 нм с использованием микропланшетного ридера Tecan Infinite200 (Infinite 200 Pro M-plex, Tecan, Швейцария). Концентрацию H₂S в сыворотке крови рассчитывали по калибровочной кривой с использованием NaHS (1–250 мкмоль/л) и выражали в мкмоль/л. Для определения содержания и интенсивности продукции H₂S в жировой ткани крыс по методу Mok Y.Y.P. и соавт. [14] фрагменты ткани гомогенизировали в ледяном 100 ммоль/л калий-фосфатном буфере (pH 7,4). К гомогенату добавляли L-цистеин (10 ммоль/л), пиридоксаль-5’-фосфат (2 ммоль/л), физиологический раствор и инкубировали в течение 30 мин (37 °C). Затем вводили ацетат цинка (1 % масс./об.) и добавляли раствор трихлоруксусной кислоты (10 % масс./об.). Для определения базального (исходного) уровня H₂S в тканях трихлоруксусную кислоту вносили непосредственно перед добавлением L-цистеина. Затем добавляли N, N-диметил-п-фенилендиаминсульфат (20 мкмоль/л) и FeCl₃ (30 мкмоль/л) в 7,2 М HCl. После инкубации смеси в течение 10 мин (37 °C) пробы центрифугировали при 10000 об/мин, отбирали супернатант и измеряли оптическую плотность (670 нм) с помощью микропланшетного ридера (Infinite 200 Pro M-plex, Tecan, Швейцария). Концентрацию H₂S рассчитывали по калибровочной кривой NaHS (1–250 мкмоль/л), результаты выражали в нмоль образовавшегося H₂S/мг белка. Активность продукции H₂S выражали в нмоль H₂S/(мин*мг белка).

Содержание активных форм кислорода (АФК) в жировой ткани определяли флуоресцентным методом [15] с помощью микропланшетного ридера (Infinite 200 Pro M-plex, Tecan, Швейцария). Для определения содержания восстановленного глутатиона (GSH) жировую ткань (100 мг) гомогенизировали в 5 % растворе сульфосалициловой кислоты, затем центрифугировали при 15000 g (2–4°С, 15 мин), собирали супернатант и фотометрировали на спектрофотометре СФ-2000 (Спектр, РФ). Количественное определение белка выполняли в реакции с бицинхониновой кислотой (BCA Protein Assay Kit, Sigma-Aldrich, США). Результаты представляли в нмоль/мг белка.

Статистическую обработку данных проводили в программе SPSS Statistics 23. Данные, подчиняющиеся нормальному закону распределения, представлены в виде среднего (М) и стандартного отклонения (±SD), неподчиняющиеся — медианы (Me), 25-го и 75-го перцентилей (Q25; Q75). Анализ различий между выборками выполняли при помощи t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна – Уитни. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Для оценки взаимосвязи между показателями определяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Диет-индуцированная экспериментальная модель МС у крыс является одним из относительно простых и доступных инструментов, позволяющих изучать взаимодействие различных факторов в механизмах формирования как самих метаболических нарушений, так и их осложнений, а также оценивать влияние различных биологически активных молекул, в том числе газомедиаторов, на патогенез МС [12, 16]. В результате проведенного эксперимента нами установлено, что содержание животных опытной группы в течение 12 недель на ВЖВУД приводило к увеличению массы тела, удельной массы висцеральной жировой ткани, а также к повышению в крови концентрации глюкозы, инсулина, лептина, триацилглицеролов и холестерола. Индекс инсулинорезистентности HOMA-IR у крыс с МС был статистически значимо выше, чем у животных группы контроля (табл. 1).

Таблица 1/ Table 1.
Показатели лабораторных и инструментальных исследований, характеризующих формирование метаболического синдрома у крыс /
Laboratory and instrumental parameters of metabolic syndrome in rats

Параметр / Parameter	Группа / Group
Параметр / Parameter	Контрольная (n = 13)/ Control (n = 13)	Опытная (n = 12)/ Experimental (n = 12)
Масса тела (г) / Body weight (g)	416,8 ± 25,1	462,5 ± 37,2*
Удельная масса жировой ткани (г)/ Adipose tissue/body weight ratio (g)	2,2 ± 0,6	3,6 ± 0,8*
Глюкоза (ммоль/л)/ Glucose (mmol/l)	5,3 ± 0,4	7,2 ± 0,6*
Инсулин (пмоль/л)/ Insulin (pmol/l)	10,9 ± 3,3	20,1 ± 5,8*
HOMA-IR	2,6 ± 0,4	6,3 ± 0,8*
Лептин (нг/мл)/ Leptin (ng/ml)	2,8 ± 0,4	4,5 ± 0,6*
Триацилглицеролы (ммоль/л)/ Triacylglycerols (mmol/l)	1,3 ± 0,2	1,8 ± 0,3*
Холестерол (ммоль/л) / Cholesterol (mmol/l)	1,9 ± 0,4	2,7 ± 0,5*

Примечание: * — различия при р < 0,05 по сравнению с контрольной группой.
Note: * р < 0,05 significance vs. control group.

Уровень АФК в жировой ткани крыс, получавших ВЖВУД, в среднем в 1,5 раза (р < 0,05) превышал соответсвующее значение в контрольной группе животных, тогда как концентрация GSH у животных опытной группы оказалась ниже в среднем в 1,4 раза (р < 0,05) у животных опытной группы (рис. 1). Таким образом, полученные нами данные подтверждают факт формирования у крыс опытной группы характерных для МС метаболических нарушений, как на системном уровне, так и на уровне прооксидантной активности жировой ткани, что, в целом, определяет воспроизведенную модель МС как приемлемую для оценки патогенетической значимости эндогенно продуцируемого H₂S у экспериментальных животных.

Рис. 1. Уровень АФК и воcстановленного глутатиона (GSH) в жировой ткани крыс контрольной и опытной группы. р — различия по сравнению с контрольной группой
Fig. 1. Concentration of ROS and reduced glutathione (GSH) in the adipose tissue of control and experimental rats. р — significance to control group

Установлено, что на фоне возникающей гипергликемии и инсулинорезистентности при питании крыс высококалорийным рационом концентрация H₂S в сыворотке крови, жировой ткани и продукция H₂S адипоцитами экспериментальных животных статистически значимо снижалась по сравнению с животными контрольной группы (табл. 2). В результате статистического анализа установлена отрицательная корреляционная связь между концентрацией H₂S, а также активностью его наработки в жировой ткани и удельной массой висцерального жира у крыс опытной группы (рис. 2).

Таблица 2 / Table 2.
Концентрация H₂S в сыворотке крови и интенсивность его продукции в жировой ткани у крыс с метаболическим синдромом /
Concentration of H₂S in serum and H₂S production in adipose tissue of rats with metabolic syndrome

Параметр / Parameter	Группа / Group
Параметр / Parameter	Контрольная (n = 13) / Control (n = 13)	Опытная (n = 12) / Experimental (n = 12)
H₂S в сыворотке крови (мкмоль/л) / Serum H₂S (μmol/l)	19,5 ± 4,6	15,2 ± 1,9*
H₂S в жировой ткани (нмоль/мг белка) / Adipose tissue H₂S (nmol/mg of protein)	1,4 ± 0,4	1,1 ± 0,2*
Продукция H₂S в жировой ткани (пмоль/(минмг белка)) / H₂S production in adipose tissue (pmol/(minmg of protein))	213,0 ± 32,1	126,9 ± 19,8*

Примечание: * — различия при р < 0,05 по сравнению с контрольной группой.
Note: * р < 0,05 significance vs. control group.

Представленные на сегодняшний день литературные данные о взаимосвязи избыточного накопления жировой ткани и системы биосинтеза H₂S неоднозначны. Ряд исследователей отмечали как увеличение [17], так и снижение [6, 18, 19] экспрессии ферментов синтеза H₂S (CBS — цистатионин-β-синтаза, CSE — цистатионин-γ-лиаза, MST — меркаптопируватсульфотрансфераза) и его продукции в клетках различных органов, в том числе жировой ткани, в зависимости от типа диеты, продолжительности высококалорийного кормления, вида экспериментальных животных. Введение in vivo доноров H₂S или стимуляция эндогенного синтеза H₂S способствовали накоплению жировой массы у мышей в эксперименте, тогда как истощение продукции H₂S предотвращало развитие ожирения у животных, вызванного диетой с высоким содержанием жиров [20]. В свою очередь, Ren H. c колл. продемонстрировали, что высококалорийная диета, содержащая концентрат молочного белка, предотвращала ожирение у крыс, что могло быть связано с увеличением уровня H₂S в плазме крови [21]. Также имеются экспериментальные данные подтверждающие, что продолжительное кормление животных калорийным рационом сопровождается дефицитом эндогенного H₂S [19]. Авторы клинических исследований сообщали о повышении концентрации H₂S в выдыхаемом воздухе у детей с ожирением [22] и увеличении концентрации H₂S плазме крови у взрослых с морбидным ожирением пропорционально увеличению жировой массы [23].

Рис. 2. Зависимость концентрации H₂S и интенсивности его продукции от массы жировой ткани у крыс контрольной и опытной группы. r — коэффициент корреляции Спирмена, р — различия по сравнению с контрольной группой
Fig. 2. Relationship of the concentration of H₂S and H₂S production with the adipose tissue/body weight ratio in rats of the control and experimental groups; r — Spearman’s correlation coefficient; р — significance vs. control group

При анализе взаимосвязи между различными биохимическими показателями и содержанием H₂S в сыворотке крови и жировой ткани было установлено, что концентрация глюкозы, инсулина и лептина в крови, а также содержание АФК в жировой ткани, отрицательно коррелировали с уровнем H₂S в сыворотке крови и в жировой ткани. Напротив, высокая концентрация GSH в жировой ткани положительно коррелировала с увеличением уровня H₂S в сыворотке крови и жировой ткани (табл. 3).

Таблица 3 / Table 3
Взаимосвязи между биохимическими показателями и концентрацией H₂S в сыворотке крови и жировой ткани крыс с метаболическим синдромом /
Correlations between biochemical parameters and H₂S concentration in blood serum and adipose tissue of rats with metabolic syndrome

Параметр / Parameter	H₂S в сыворотке крови (мкмоль/л)/ Serum H₂S (μmol/l)	H₂S в жировой ткани (нмоль/мг белка)/ Adipose tissue H₂S (nmol/mg of protein)
Глюкоза (ммоль/л)/ Glucose (mmol/l)	–0,55*	–0,62*
Инсулин (пмоль/л)/ Insulin (pmol/l)	–0,42*	–0,32
Лептин (нг/мл)/ Leptin (ng/ml)	–0,56*	–0,36*
АФК жировой ткани (усл. ед.)/ Adipose tissue ROS (a. u.)	–0,49*	–0,63*
GSH жировой ткани (нмоль/мг белка)/ Adipose tissue GSH (nmol/mg of protein)	0,45*	0,43*

Примечание: * — р < 0,05.
Note: * р < 0,05.

Вопрос о том, каким образом гипергликемия влияет на биосинтез H₂S остается спорным. Было обнаружено, что высокий уровень глюкозы (20 ммоль/л) подавлял выработку H₂S в клетках инсулиномы крысы INS-1E. Напротив, глюкоза в концентрации 10 или 20 ммоль/л индуцировала выработку H₂S в мышиных β-клетках островков MIN6 за счет усиления экспрессии CSE [24]. В экспериментах Wu L. и колл. было показано, что у крыс Zucker с диабетом и ожирением скорость продукции эндогенного H₂S была выше, чем у крыс без диабета, а ингибирование его продукции способствовало восстановлению уровня глюкозы почти до нормального уровня [25]. Сходные результаты были получены на мышиной модели ожирения с донором GYY4137 [155]. В литературе имеются данные, что как эндогенный, так и экзогенный H₂S ингибируют секрецию инсулина β-клетками поджелудочной железы [11, 17]. Установлено, что газомедиатор H₂S вовлечен в регуляцию инсулин-зависимого поглощения глюкозы жировой тканью. При этом сообщается как о стимуляции [26], так и о торможении этого процесса H₂S за счет его влияния на различные молекулярные мишени, такие как ГЛЮТ-4, PPARγ, PIP3, Akt [10, 21].

Результаты проведенных нами лабораторных тестов свидетельствуют об усилении метаболической активности жировой ткани у животных с МС (гиперлептинемия), а также о сдвиге редокс-баланса жировой ткани в сторону прооксидантной активности (повышение концентрации АФК и снижение уровня GSH). В литературе представлены данные об участии H₂S в регуляции окислительно-восстановительного гомеостаза клеток путем посттрансляционной модификаций остатков цистеина (RSH) в персульфиды (RSSH), активации антиоксидантных ферментов, таких как глутатионпероксидаза и супероксиддисмутаза, увеличения в клетках GSH [7, 8] Выявленная нами отрицательная корреляция между концентрацией H₂S, уровнем лептина и АФК в жировой ткани свидетельствует о вовлечении системы эндогенного биосинтеза H₂S в патогенез метаболических нарушений, индуцированных ВЖВУД у экспериментальных животных. При этом снижение концентрации H₂S может рассматриваться как один из факторов системной воспалительной реакции, ассоциированной с ожирением и МС. Тем не менее, широкий спектр и неоднозначность направленности биологических эффектов газомедиатора H₂S создают предпосылки для дальнейшего изучения его роли в физиологических условиях и при развитии метаболических нарушений.

Выводы

Несмотря на всестороннее изучение влияния H₂S на регуляцию различных клеточных функций, сведения о его значимости в развитии и прогрессировании МС продолжают раскрываться и являются во многом противоречивыми. В нашей работе показано, что выраженные нарушения обмена веществ, характеризующие развитие МС у экспериментальных животных (гипергликемия, инсулинемия, лептинемия, прооксидантный редокс-статус), сопровождаются снижением сывороточной концентрации H₂S и его продукции в жировой ткани. Приняв во внимание вовлеченность системы эндогенного биосинтеза H₂S в оперирование процессов регуляции гомеостаза, следует подчеркнуть актуальность дальнейшего изучения клеточных и молекулярных механизмов действия газомедиатора H₂S на клетки-мишени в норме и при метаболической патологии.