The role of endogenous H2S in experimental metabolic syndrome

Julia G. Birulina; Бирулина Ю. Г.; Vladimir V. Ivanov; Иванов В. В.; Evgeny E. Buyko; Буйко Е. Е.; Olga V. Voronkova; Воронкова О. В.; Nikita A. Chernyshov; Чернышов Н. А.; Svetlana V. Gusakova; Гусакова С. В.

doi:10.22363/2313-0245-2024-28-3-331-339

Роль эндогенного H2S при экспериментальном метаболическом синдроме

Авторы: Бирулина Ю.Г.¹, Иванов В.В.¹, Буйко Е.Е.¹, Воронкова О.В.¹, Чернышов Н.А.¹, Гусакова С.В.¹
Учреждения:
1. Сибирский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 28, № 3 (2024): ФИЗИОЛОГИЯ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ
Страницы: 331-339
Раздел: ФИЗИОЛОГИЯ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ
URL: https://journals.rudn.ru/medicine/article/view/40853
DOI: https://doi.org/10.22363/2313-0245-2024-28-3-331-339
EDN: https://elibrary.ru/AFKRGE

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Актуальность. Газовый трансмиттер сероводород (H₂S) известен как сигнальная молекула, участвующая в регуляции многих клеточных функций в норме и при патологических состояниях. В последнее время активно изучаются биологические эффекты H₂S при ожирении и метаболическом синдроме (МС) с позиции перспективы разработки фармакологических агентов, обеспечивающих патогенетически обоснованную коррекцию данного синдрома и ассоциированных с ним заболеваний. Цель работы состояла в изучении роли эндогенно продуцируемого H₂S в патогенезе метаболических нарушений при экспериментальном МС. Материалы и методы. Моделирование диет-индуцированного МС выполняли на крысах-самцах Wistar с помощью высокожировой и высокоуглеводной диеты. У животных определяли массу тела и жировой ткани. В сыворотке крови измеряли показатели углеводного и липидного обмена с использованием наборов реагентов. В жировой ткани фотометрически анализировали уровень активных форм кислорода (АФК) и восстановленного глутатиона (GSH). Концентрацию H₂S в сыворотке крови, жировой ткани и интенсивность его продукции регистрировали спектрофотометрически. Результаты и обсуждение. Установлено, что на фоне гипергликемии и инсулинорезистентности снижалась концентрация H₂S в сыворотке крови, жировой ткани и интенсивность продукции H₂S клетками жировой ткани. Выявлена отрицательная корреляция между содержанием H₂S, его продукцией в жировой ткани крыс и массой висцеральной жировой ткани. Обнаружена отрицательная взаимосвязь между концентрацией глюкозы, инсулина, лептина, АФК и уровнем H₂S в сыворотке крови и жировой ткани. Напротив, повышение GSH в жировой ткани прямо коррелировало с увеличением уровня H₂S в сыворотке крови и клетках жировой ткани. Выводы. Несмотря на всестороннее изучение регуляторного действия H₂S на функцию клеток-мишеней, сведения о его значимости в развитии и прогрессировании МС весьма неоднозначны и продолжают раскрываться. В нашей работе показано, что в условиях метаболической патологии происходит снижение сывороточной концентрации H₂S и его продукции в жировой ткани, которое коррелирует с развитием ожирения, гипергликемии, инсулинемии, лептинемии, нарушением редокс-статуса.

Ключевые слова

сероводород, метаболический синдром, ожирение, гипергликемия, инсулинорезистентность

Полный текст

Введение

Газотрансмиттеры представляют собой небольшие молекулы эндогенного газа, которые обладают способностью диффундировать в клетки для взаимодействия со своими мишенями и индуцировать ряд внутриклеточных реакций сигнальной трансдукции [1, 2]. Ввиду высокой растворимости в липидах для проникновения через клеточные мембраны газотрансмиттерам не требуется взаимодействие с рецепторами плазматической мембраны, равно как и участие специального переносчика для передачи сигнала.

Сероводород (H₂S), наряду с оксидом азота (NO) и оксидом углерода (CO), также принадлежит к семейству газомедиаторов [3]. Несмотря на то, что H₂S был ранее известен как токсичный газ, многочисленные экспериментальные исследования показывают, что он производится ферментативно во многих клетках организма млекопитающих и человека, а также опосредует ряд таких физиологических функций, как регуляция сосудистого тонуса, ангиогенез [4], нейротрансмиссия [5], продукция инсулина [6], апоптоз, воспалительная реакция [7] и др. Показано, что свои эффекты H₂S реализует через широкий спектр сигнальных молекул, реагируя с супероксид-анионом, перекисью водорода, пероксинитритом, тиоловыми производными и NO, воздействует на различные транскрипционные факторы (Nrf2, FoxO3, NF-kB) [8, 9], а также ионные каналы [4] в клетках-мишенях.

В то же время в литературе имеются сведения о том, что при различных патологических состояниях, ассоциированных с нарушением обмена веществ, таких как сахарный диабет, ожирение, метаболический синдром (МС), происходит нарушение продукции и снижение биодоступности H₂S [10, 11]. Метаболические и гемодинамические нарушения, возникающие при МС, вероятно, оказывают влияние на баланс данного газомедиатора и механизмы его воздействия. Противоречивость данных об эффекторном потенциале H₂S при МС, а также ассоциированных с ним социально-значимых заболеваний, делает его перспективным объектом для исследований. Существующие на сегодняшний день сведения о влиянии H₂S на клеточный гомеостаз позволяют рассматривать его в качестве возможного претендента на роль протекторного биологического агента.

Таким образом, целью исследования явилось изучение роли эндогенно продуцируемого H₂S в патогенезе метаболических нарушений при экспериментальном МС.

Материал и методы

Для исследований было выполнено моделирование МС в эксперименте на крысах-самцах Wistar (25 самцов, возраст на начало исследования 6 недель) по ранее описанной методике [12]. Протокол исследования был одобрен Комиссией по контролю содержания и использования лабораторных животных (IACUC) ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (протокол № 1 от 25.04.2022 г.). Крысы контрольной группы получали стандартный корм («Чара», Ассортимент-Агро, РФ). Крысы опытной группы в течение 12 недель находились на высокожировой и высокоуглеводной диете (ВЖВУД) с заменой питьевой воды на 20 % раствор фруктозы. Животных выводили из эксперимента СО₂-эвтаназией. Выполняли забор крови из сердца, которую затем центрифугировали (2000 g, 10 мин) для получения сыворотки. Извлекали и взвешивали висцеральную жировую ткань. В сыворотке крови определяли концентрацию глюкозы (Glucose-TR, Chronolab, Испания), инсулина (Insulin Rat ELISA Kit, Thermo Fisher Scientifiс, США), лептина (Rat Leptin ELISA Kit, ELK Biotechnology, КНР). Рассчитывали индекс HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance) по формуле: (сывороточный инсулин) × (сывороточная глюкоза)/22,5.

Концентрацию H₂S в сыворотке крови определяли по методике Li L. и соавт. [13], для чего аликвоты сыворотки смешивали с дистиллированной водой, ацетатом цинка (1 % масс./об.), трихлоруксусной кислотой (10 % масс./об.), N, N-диметил-п-фенилендиаминсульфат (20 мкмоль/л) и FeCl₃ (30 мкмоль/л) в 7,2 М HCl. Через 15 мин измеряли оптическую плотность при 670 нм с использованием микропланшетного ридера Tecan Infinite200 (Infinite 200 Pro M-plex, Tecan, Швейцария). Концентрацию H₂S в сыворотке крови рассчитывали по калибровочной кривой с использованием NaHS (1–250 мкмоль/л) и выражали в мкмоль/л. Для определения содержания и интенсивности продукции H₂S в жировой ткани крыс по методу Mok Y.Y.P. и соавт. [14] фрагменты ткани гомогенизировали в ледяном 100 ммоль/л калий-фосфатном буфере (pH 7,4). К гомогенату добавляли L-цистеин (10 ммоль/л), пиридоксаль-5’-фосфат (2 ммоль/л), физиологический раствор и инкубировали в течение 30 мин (37 °C). Затем вводили ацетат цинка (1 % масс./об.) и добавляли раствор трихлоруксусной кислоты (10 % масс./об.). Для определения базального (исходного) уровня H₂S в тканях трихлоруксусную кислоту вносили непосредственно перед добавлением L-цистеина. Затем добавляли N, N-диметил-п-фенилендиаминсульфат (20 мкмоль/л) и FeCl₃ (30 мкмоль/л) в 7,2 М HCl. После инкубации смеси в течение 10 мин (37 °C) пробы центрифугировали при 10000 об/мин, отбирали супернатант и измеряли оптическую плотность (670 нм) с помощью микропланшетного ридера (Infinite 200 Pro M-plex, Tecan, Швейцария). Концентрацию H₂S рассчитывали по калибровочной кривой NaHS (1–250 мкмоль/л), результаты выражали в нмоль образовавшегося H₂S/мг белка. Активность продукции H₂S выражали в нмоль H₂S/(мин*мг белка).

Содержание активных форм кислорода (АФК) в жировой ткани определяли флуоресцентным методом [15] с помощью микропланшетного ридера (Infinite 200 Pro M-plex, Tecan, Швейцария). Для определения содержания восстановленного глутатиона (GSH) жировую ткань (100 мг) гомогенизировали в 5 % растворе сульфосалициловой кислоты, затем центрифугировали при 15000 g (2–4°С, 15 мин), собирали супернатант и фотометрировали на спектрофотометре СФ-2000 (Спектр, РФ). Количественное определение белка выполняли в реакции с бицинхониновой кислотой (BCA Protein Assay Kit, Sigma-Aldrich, США). Результаты представляли в нмоль/мг белка.

Статистическую обработку данных проводили в программе SPSS Statistics 23. Данные, подчиняющиеся нормальному закону распределения, представлены в виде среднего (М) и стандартного отклонения (±SD), неподчиняющиеся — медианы (Me), 25-го и 75-го перцентилей (Q25; Q75). Анализ различий между выборками выполняли при помощи t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна – Уитни. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Для оценки взаимосвязи между показателями определяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Диет-индуцированная экспериментальная модель МС у крыс является одним из относительно простых и доступных инструментов, позволяющих изучать взаимодействие различных факторов в механизмах формирования как самих метаболических нарушений, так и их осложнений, а также оценивать влияние различных биологически активных молекул, в том числе газомедиаторов, на патогенез МС [12, 16]. В результате проведенного эксперимента нами установлено, что содержание животных опытной группы в течение 12 недель на ВЖВУД приводило к увеличению массы тела, удельной массы висцеральной жировой ткани, а также к повышению в крови концентрации глюкозы, инсулина, лептина, триацилглицеролов и холестерола. Индекс инсулинорезистентности HOMA-IR у крыс с МС был статистически значимо выше, чем у животных группы контроля (табл. 1).

Таблица 1/ Table 1.
Показатели лабораторных и инструментальных исследований, характеризующих формирование метаболического синдрома у крыс /
Laboratory and instrumental parameters of metabolic syndrome in rats

Параметр / Parameter	Группа / Group
Параметр / Parameter	Контрольная (n = 13)/ Control (n = 13)	Опытная (n = 12)/ Experimental (n = 12)
Масса тела (г) / Body weight (g)	416,8 ± 25,1	462,5 ± 37,2*
Удельная масса жировой ткани (г)/ Adipose tissue/body weight ratio (g)	2,2 ± 0,6	3,6 ± 0,8*
Глюкоза (ммоль/л)/ Glucose (mmol/l)	5,3 ± 0,4	7,2 ± 0,6*
Инсулин (пмоль/л)/ Insulin (pmol/l)	10,9 ± 3,3	20,1 ± 5,8*
HOMA-IR	2,6 ± 0,4	6,3 ± 0,8*
Лептин (нг/мл)/ Leptin (ng/ml)	2,8 ± 0,4	4,5 ± 0,6*
Триацилглицеролы (ммоль/л)/ Triacylglycerols (mmol/l)	1,3 ± 0,2	1,8 ± 0,3*
Холестерол (ммоль/л) / Cholesterol (mmol/l)	1,9 ± 0,4	2,7 ± 0,5*

Примечание: * — различия при р < 0,05 по сравнению с контрольной группой.
Note: * р < 0,05 significance vs. control group.

Уровень АФК в жировой ткани крыс, получавших ВЖВУД, в среднем в 1,5 раза (р < 0,05) превышал соответсвующее значение в контрольной группе животных, тогда как концентрация GSH у животных опытной группы оказалась ниже в среднем в 1,4 раза (р < 0,05) у животных опытной группы (рис. 1). Таким образом, полученные нами данные подтверждают факт формирования у крыс опытной группы характерных для МС метаболических нарушений, как на системном уровне, так и на уровне прооксидантной активности жировой ткани, что, в целом, определяет воспроизведенную модель МС как приемлемую для оценки патогенетической значимости эндогенно продуцируемого H₂S у экспериментальных животных.

Рис. 1. Уровень АФК и воcстановленного глутатиона (GSH) в жировой ткани крыс контрольной и опытной группы. р — различия по сравнению с контрольной группой
Fig. 1. Concentration of ROS and reduced glutathione (GSH) in the adipose tissue of control and experimental rats. р — significance to control group

Установлено, что на фоне возникающей гипергликемии и инсулинорезистентности при питании крыс высококалорийным рационом концентрация H₂S в сыворотке крови, жировой ткани и продукция H₂S адипоцитами экспериментальных животных статистически значимо снижалась по сравнению с животными контрольной группы (табл. 2). В результате статистического анализа установлена отрицательная корреляционная связь между концентрацией H₂S, а также активностью его наработки в жировой ткани и удельной массой висцерального жира у крыс опытной группы (рис. 2).

Таблица 2 / Table 2.
Концентрация H₂S в сыворотке крови и интенсивность его продукции в жировой ткани у крыс с метаболическим синдромом /
Concentration of H₂S in serum and H₂S production in adipose tissue of rats with metabolic syndrome

Параметр / Parameter	Группа / Group
Параметр / Parameter	Контрольная (n = 13) / Control (n = 13)	Опытная (n = 12) / Experimental (n = 12)
H₂S в сыворотке крови (мкмоль/л) / Serum H₂S (μmol/l)	19,5 ± 4,6	15,2 ± 1,9*
H₂S в жировой ткани (нмоль/мг белка) / Adipose tissue H₂S (nmol/mg of protein)	1,4 ± 0,4	1,1 ± 0,2*
Продукция H₂S в жировой ткани (пмоль/(минмг белка)) / H₂S production in adipose tissue (pmol/(minmg of protein))	213,0 ± 32,1	126,9 ± 19,8*

Примечание: * — различия при р < 0,05 по сравнению с контрольной группой.
Note: * р < 0,05 significance vs. control group.

Представленные на сегодняшний день литературные данные о взаимосвязи избыточного накопления жировой ткани и системы биосинтеза H₂S неоднозначны. Ряд исследователей отмечали как увеличение [17], так и снижение [6, 18, 19] экспрессии ферментов синтеза H₂S (CBS — цистатионин-β-синтаза, CSE — цистатионин-γ-лиаза, MST — меркаптопируватсульфотрансфераза) и его продукции в клетках различных органов, в том числе жировой ткани, в зависимости от типа диеты, продолжительности высококалорийного кормления, вида экспериментальных животных. Введение in vivo доноров H₂S или стимуляция эндогенного синтеза H₂S способствовали накоплению жировой массы у мышей в эксперименте, тогда как истощение продукции H₂S предотвращало развитие ожирения у животных, вызванного диетой с высоким содержанием жиров [20]. В свою очередь, Ren H. c колл. продемонстрировали, что высококалорийная диета, содержащая концентрат молочного белка, предотвращала ожирение у крыс, что могло быть связано с увеличением уровня H₂S в плазме крови [21]. Также имеются экспериментальные данные подтверждающие, что продолжительное кормление животных калорийным рационом сопровождается дефицитом эндогенного H₂S [19]. Авторы клинических исследований сообщали о повышении концентрации H₂S в выдыхаемом воздухе у детей с ожирением [22] и увеличении концентрации H₂S плазме крови у взрослых с морбидным ожирением пропорционально увеличению жировой массы [23].

Рис. 2. Зависимость концентрации H₂S и интенсивности его продукции от массы жировой ткани у крыс контрольной и опытной группы. r — коэффициент корреляции Спирмена, р — различия по сравнению с контрольной группой
Fig. 2. Relationship of the concentration of H₂S and H₂S production with the adipose tissue/body weight ratio in rats of the control and experimental groups; r — Spearman’s correlation coefficient; р — significance vs. control group

При анализе взаимосвязи между различными биохимическими показателями и содержанием H₂S в сыворотке крови и жировой ткани было установлено, что концентрация глюкозы, инсулина и лептина в крови, а также содержание АФК в жировой ткани, отрицательно коррелировали с уровнем H₂S в сыворотке крови и в жировой ткани. Напротив, высокая концентрация GSH в жировой ткани положительно коррелировала с увеличением уровня H₂S в сыворотке крови и жировой ткани (табл. 3).

Таблица 3 / Table 3
Взаимосвязи между биохимическими показателями и концентрацией H₂S в сыворотке крови и жировой ткани крыс с метаболическим синдромом /
Correlations between biochemical parameters and H₂S concentration in blood serum and adipose tissue of rats with metabolic syndrome

Параметр / Parameter	H₂S в сыворотке крови (мкмоль/л)/ Serum H₂S (μmol/l)	H₂S в жировой ткани (нмоль/мг белка)/ Adipose tissue H₂S (nmol/mg of protein)
Глюкоза (ммоль/л)/ Glucose (mmol/l)	–0,55*	–0,62*
Инсулин (пмоль/л)/ Insulin (pmol/l)	–0,42*	–0,32
Лептин (нг/мл)/ Leptin (ng/ml)	–0,56*	–0,36*
АФК жировой ткани (усл. ед.)/ Adipose tissue ROS (a. u.)	–0,49*	–0,63*
GSH жировой ткани (нмоль/мг белка)/ Adipose tissue GSH (nmol/mg of protein)	0,45*	0,43*

Примечание: * — р < 0,05.
Note: * р < 0,05.

Вопрос о том, каким образом гипергликемия влияет на биосинтез H₂S остается спорным. Было обнаружено, что высокий уровень глюкозы (20 ммоль/л) подавлял выработку H₂S в клетках инсулиномы крысы INS-1E. Напротив, глюкоза в концентрации 10 или 20 ммоль/л индуцировала выработку H₂S в мышиных β-клетках островков MIN6 за счет усиления экспрессии CSE [24]. В экспериментах Wu L. и колл. было показано, что у крыс Zucker с диабетом и ожирением скорость продукции эндогенного H₂S была выше, чем у крыс без диабета, а ингибирование его продукции способствовало восстановлению уровня глюкозы почти до нормального уровня [25]. Сходные результаты были получены на мышиной модели ожирения с донором GYY4137 [155]. В литературе имеются данные, что как эндогенный, так и экзогенный H₂S ингибируют секрецию инсулина β-клетками поджелудочной железы [11, 17]. Установлено, что газомедиатор H₂S вовлечен в регуляцию инсулин-зависимого поглощения глюкозы жировой тканью. При этом сообщается как о стимуляции [26], так и о торможении этого процесса H₂S за счет его влияния на различные молекулярные мишени, такие как ГЛЮТ-4, PPARγ, PIP3, Akt [10, 21].

Результаты проведенных нами лабораторных тестов свидетельствуют об усилении метаболической активности жировой ткани у животных с МС (гиперлептинемия), а также о сдвиге редокс-баланса жировой ткани в сторону прооксидантной активности (повышение концентрации АФК и снижение уровня GSH). В литературе представлены данные об участии H₂S в регуляции окислительно-восстановительного гомеостаза клеток путем посттрансляционной модификаций остатков цистеина (RSH) в персульфиды (RSSH), активации антиоксидантных ферментов, таких как глутатионпероксидаза и супероксиддисмутаза, увеличения в клетках GSH [7, 8] Выявленная нами отрицательная корреляция между концентрацией H₂S, уровнем лептина и АФК в жировой ткани свидетельствует о вовлечении системы эндогенного биосинтеза H₂S в патогенез метаболических нарушений, индуцированных ВЖВУД у экспериментальных животных. При этом снижение концентрации H₂S может рассматриваться как один из факторов системной воспалительной реакции, ассоциированной с ожирением и МС. Тем не менее, широкий спектр и неоднозначность направленности биологических эффектов газомедиатора H₂S создают предпосылки для дальнейшего изучения его роли в физиологических условиях и при развитии метаболических нарушений.

Выводы

Несмотря на всестороннее изучение влияния H₂S на регуляцию различных клеточных функций, сведения о его значимости в развитии и прогрессировании МС продолжают раскрываться и являются во многом противоречивыми. В нашей работе показано, что выраженные нарушения обмена веществ, характеризующие развитие МС у экспериментальных животных (гипергликемия, инсулинемия, лептинемия, прооксидантный редокс-статус), сопровождаются снижением сывороточной концентрации H₂S и его продукции в жировой ткани. Приняв во внимание вовлеченность системы эндогенного биосинтеза H₂S в оперирование процессов регуляции гомеостаза, следует подчеркнуть актуальность дальнейшего изучения клеточных и молекулярных механизмов действия газомедиатора H₂S на клетки-мишени в норме и при метаболической патологии.