Влияние засухи на антиоксидантную активность кукурузы из различных почвенно-климатических регионов

Полный текст

Введение Окружающая среда постоянно подвергается воздействию абиотического стресса, что негативно сказывается в целом на экономической ситуации и в частности на сельском хозяйстве. Эволюционное развитие растений в сухих условиях сопровождалось экстремальными температурными диапазонами [1]. Впоследствии процесс окультуривания сельскохозяйственных растений происходил в благоприятных условиях [2]. Фактически возникала потребность в создании таких сортов растений, у которых стрессовые факторы не влияли бы на продуктивность [3]. На сегодняшний день человечество сталкивается в основном с двумя истощающимися во времени ресурсами - почвой и водой. В этом контексте прогнозируется ситуация с дальнейшим драматическим развитием, поскольку глобальное повышение температуры и увеличение углекислого газа влекут за собой изменение локального микроклимата, что приводит непосредственно к снижению урожайности сельскохозяйственных культур [4]. Исходя из вышесказанного возникает необходимость проведения стратегически необходимых исследований, направленных на разработку и изучение генетически модифицированных растений, полученных на основе анализа гиперэкспрессии генотипов с целью повышения их толерантности к абиотическим стрессам [5; 6]. Анализ экспрессии генов растений в ответ на абиотические стрессы показывает, что наибольшая часть генома может быть разрушена за счет непосредственного отклика (отражаясь) на защитные реакции [7]. Сложность ответных реакций самого растительного организма на разрушающие факторы абиотического стресса в тандеме с его генетической конституцией выражается в слаженной работе морфофизиологических и биохимических механизмов [8]. Именно при исследовании последних можно определить основные принципы работы адаптационных механизмов, которые и приводят к экспрессии толерантности и адаптации в окружающей среде. В представленной работе изучена ответная реакция на засуху антиоксидантной системы защиты однолетнего растения - сахарной кукурузы и проведено его сравнение с контрольным генно-модифицированным образцом кукурузы инбредной линии В73. Материалы и методы В качестве объекта исследований были выбраны сорта армянской популяции полузубовидной кукурузы, распространенной в Лорийском районе Армении близ реки Дебет (Шнох - 41°08′52″ с.ш., 44°50′16″ в. д., Техут - 41°07′05″ с.ш., 44°50′45″ в. д.) и кукурузы В73 (Iowa Stiff Stalk Synthetic) в качестве биологического контроля [9]. Моделирование засухи. Моделирование абиотической засухи осуществлялось согласно методике, описанной в работе [24]. С целью определения основных показателей антиоксидантной системы срезывался пятый лист кукурузы на третий день его роста. Затем зона роста листа (10 см от основания листа) разделялась по 1 см, полученные образцы помещались в специальную кювету в условиях -80 °С (жидкий азот) для использования во всех экспериментах. Определение концентрации 2-тиобарбирутовой кислоты (ТБК) - активных продуктов. Образцы растений экстрагировались в 2 мл 80%-го этанола. Затем измерялась интенсивность образования интенсивной розовой окраски проб в присутствии ТБК по методике [11]. Количество малонового диальдегида (МДА) рассчитывали по формуле [6,45 × (А532 - А600) - 0,56 · А440] / 0,478. Определение железовосстановительной активности плазмы (FRAP). Железовосстановительная активность плазмы позволяет устанавливать антиоксидантную активность растительного экстракта [12]. Экстракты растения готовились на основе 80%-го этанола, затем смешивались в 0,3 М ацетатном буфере (pH = 3,6), содержащем 10 мМ 2,4,6 трис (2 пиридил) s-триазин (ТПТЗ) и 200 мМ FeCl3. Оптическая плотность измерялась при 600 нм на планшетном спектрофотометре. В качестве стандарта (контроля) использовалась 6-гидро-2,5,7,8-тетра метилхром2-карбоксильная кислота (троксол). Определение полифенолов. Растительный материал экстрагировался в водном растворе 80%-го этанола с помощью реактива Фолина - Чаколтеу, и определялась концентрация полифенолов [13]. Оптическая плотность измерялась при 765 нм, а галловая кислота (ГК) использовалась в качестве стандарта (контроля). Определение флавоноидов. Для определения концентрации общих флавоноидов были приготовлены экстракты растительной ткани на основе 10%-го хлорида алюминия и 1 М ацетата калия [14]. После 30-минутной инкубации при комнатной температуре в темноте измерялась оптическая плотность при 415 нм, в качестве стандарта (контроля) использовался кверцетин. Статистическая обработка. Все проведенные эксперименты имели 10 биологических и до 5 технических повторностей. Концентрации всех биохимических показателей представлены в соответствующий единицах, приведенных к грамму свежего веса биологического материала (г СВ). Результаты были обработаны с помощью программы MatLab с учетом t-критерия Стьюдента. Наблюдаемые различия статистически значимы, так как при уровне значимости р < 0,05 рассчитанные значения критерия были больше критического [15; 16]. Результаты и их обсуждение Растения часто сталкиваются с широким спектром абиотических стрессов, включая высокую температуру, засоление, засуху, озон и т.п. Среди перечисленных стресс-факторов засуха является серьезной угрозой для поддержания продовольственной безопасности с учетом прогнозов глобальных климатических изменений в ближайшем будущем. Растительный организм в определенной степени способен выдерживать ограниченность в доступности воды. Но в ответ на засуху для большинства культивируемых растений в качестве ответной реакции зафиксирована широкая генотипическая изменчивость [17]. Ограничение поступающей в растение воды приводит к необратимым изменениям в физиологических процессах, включая и антиоксидантный аппарат защиты растения [18]. В наших предыдущих работах были исследованы изменения некоторых физиологических параметров роста кукурузы при модулируемой засухе [24]. В частности, было установлено, что ограниченное поступление воды включает адаптационные механизмы, вызывает определенные физиологические изменения в высших растениях, замедляя их рост и продуктивность. При этом адаптационные механизмы растений регулируют вызванные изменением степени засухи с поверхности листьев (транспирация). Изучение кинетических параметров роста растения в условиях моделируемой засухи показало, что величина транспирации может быть использована в качестве критерия при оценке последствий абиотического стресса на ряд физиологических показателей роста растения [25]. В данном контексте возникла необходимость исследований по выявлению механизмов регулирования действия засухи нa антиоксидантную систему кукурузы по количественным изменениям некоторых ее показателей. На начальной стадии экспериментов были выявлены концентрационные изменения ТБКактивных продуктов окисления. Согласно полученным результатам (см. таблицу), у образцов из населенного пункта Ушакерт концентрация МДА была в два раза больше по сравнению с контрольным образцом В73. Концентрация вторичного продукта окисления липидсодержащих структур биологического образца из Техута превышала значения того же параметра у контрольного образца на 50 %. При исследовании образцов из населенных пунктов Шнох и Одзун изменения значения МДА были в пределах среднеквадратического. Умеренная засуха вызвала активацию в защитных механизмах, что выразилось в повышении концентрации МДА у биологического контроля более чем в три раза. Аналогичное повышение численного значения МДА наблюдается соответственно у образцов из Одзуна и Техута на 19 %, у биологического материала из Ушакерта - на 47 %, а в случае образцов из населенного пункта Шнох концентрационные изменения МДА были выше более чем в два раза. Снижение относительной влажности почвы до 34 % позволило смоделировать сильную засуху. Дефицит поливочной воды вызвал резкое повышение концентрации МДА у биологического контроля В73 (почти в пять раз). Соответственные изменения в липидсодержащих структурах исследуемого биологического материала кукурузы наблюдались и у остальных образцов. Так, при сильной засухе концентрация МДА, по сравнению с контрольным значением, увеличилась у всех образцов кукурузы армянской популяции в среднем в 2,5 раза. Таблица Концентрация биохимических показателей антиоксидантной активности кукурузы при моделируемой засухе Вариант засухи Техут Шнох Одзун Ушакерт В73 МДА (мкМоль/г СВ) Контроль 3,733 ± 0,203 2,366 ± 0,047 2,382 ± 0,059 4,662 ± 0,818 2,372 ± 0,079 Умеренная засуха 4,476 ± 0,561 5,455 ± 0,046 2,853 ± 0,141 6,888 ± 1,465 7,707 ± 0,225 Сильная засуха 8,416 ± 2,118 6,435 ± 0,035 6,543 ± 0,296 10,486 ± 1,721 11,669 ± 0,125 FRAP (мкл Троксол/г СВ) Контроль 3005,186 ± 38,238 1930,249 ± 48,0194 1042,218 ± 12,763 1532,627 ± 12,527 1250,237 ± 12,228 Умеренная засуха 4645,731 ± 10,724 3402,707 ± 10,535 1123,674 ± 17,786 2082,828 ± 14,873 2636,328 ± 16,308 Сильная засуха 8371,859 ± 24,963 4363,721 ± 11,160 3023,069 ± 20,017 1811,548 ± 15,814 2945,556 ± 15,737 Полифеннолы (мг ГК/г СВ) Контроль 148,25 ± 5,444 122,452 ± 4,237 116,347 ± 2,686 126,928 ± 1,983 90,554 ± 3,836 Умеренная засуха 181,454 ± 4,289 177,759 ± 1,666 108,881 ± 7,134 122,62 ± 1,488 210,120 ± 2,262 Сильная засуха 391,261 ± 3,533 316,945 ± 4,736 324,154 ± 3,380 147,885 ± 2,271 281,302 ± 2,227 Флавоноиды (мг Кверцетина/г СВ) Контроль 208,72 ± 2,037 240,281 ± 1,997 218,255 ± 2,819 318,703 ± 2,254 233,946 ± 1,508 Умеренная засуха 263,8 ± 3,868 422,828 ± 2,347 216,798 ± 1,246 441,055 ± 3,810 520,036 ± 1,483 Сильная засуха 605,996 ± 56,560 630,219 ± 13,408 538,201 ± 3,061 435,211 ± 3,403 606,820 ± 25,518 The concentration of biochemical parameters of the antioxidant activity of maize under drought stress Table Drought type Tekhut Shnogh Odzun Hushakert В73 MDA (μmol/g FW) Control 3.733 ± 0.203 2.366 ± 0.047 2.382 ± 0.059 4.662 ± 0.818 2.372 ± 0.079 Mild stress 4.476 ± 0.561 5.455 ± 0.046 2.853 ± 0.141 6.888 ± 1.465 7.707 ± 0.225 Severe stress 8.416 ± 2.118 6.435 ± 0.035 6.543 ± 0.296 10.486 ± 1.721 11.669 ± 0.125 FRAP (μlTrolox/g FW) Control 3005.186 ± 38.238 1930.249 ± 48.0194 1042.218 ± 12.763 1532.627 ± 12.527 1250.237 ± 12.228 Mild stress 4645.731 ± 10.724 3402.707 ± 10.535 1123.674 ± 17.786 2082.828 ± 14.873 2636.328 ± 16.308 Severe stress 8371.859 ± 24.963 4363.721 ± 11.160 3023.069 ± 20.017 1811.548 ± 15.814 2945.556 ± 15.737 Polyphenols (mg GA/g FW) Control 148.25 ± 5.444 122.452 ± 4.237 116.347 ± 2.686 126.928 ± 1.983 90.554 ± 3.836 Mild stress 181.454 ± 4.289 177.759 ± 1.666 108.881 ± 7.134 122.62 ± 1.488 210.120 ± 2.262 Severe stress 391.261 ± 3.533 316.945 ± 4.736 324.154 ± 3.380 147.885 ± 2.271 281.302 ± 2.227 Flavonoids (mg QA/g FW) Control 208.72 ± 2.037 240.281 ± 1.997 218.255 ± 2.819 318.703 ± 2.254 233.946 ± 1.508 Mild stress 263.8 ± 3.868 422.828 ± 2.347 216.798 ± 1.246 441.055 ± 3.810 520.036 ± 1.483 Severe stress 605.996 ± 56.560 630.219 ± 13.408 538.201 ± 3.061 435.211 ± 3.403 606.820 ± 25.518 Исследуемые образцы армянской популяции сахарной кукурузы отличались по ареалу произрастания, в том числе по концентрации железа в почвенном покрове [26]. Исходя из вышесказанного целью работы было выявление концентрационных изменений по восстановлению низкомолекулярного антиоксидантами железа (ferric reducing/antioxidant power - FRAP) [27] (см. таблицу). Так, значение FRAP у образца кукурузы из Техута было в 2,4 раза выше, а у биологического материала кукурузы из Одзуна - на 17 % ниже. Умеренная засуха вызвала повышение концентрации FRAP у биологического контроля в 2,1 раза, а у всех образцов армянской популяции кукурузы - почти в 1,5 раза. При усилении режима водного дефицита почти вдвое сильная засуха привела к незначительным концентрационным изменениям восстановленного железа. У контрольного биологического образца сильная засуха увеличила значение концентрации FRAP в 2,4 раза, а в случае с образцами из населенных пунктов Одзун, Шнох и Техут - в среднем в 2,7 раза. Лишь образцы из Ушакерта имели сравнительно незначительные концентрационные изменения (увеличение в 1,8 раза). Полифенолы по своей природе являются сильными поглотителями свободных радикалов. Исходя из этого, в последующих экспериментах исследовалась динамика концентрационных изменений полифенолов в биологическом материале кукурузы (см. таблицу). Все образцы растений армянской популяции имели большее содержание общих полифенолов по сравнению с контрольным образцом В73. Но умеренная засуха вызвала ответную реакцию у биологического контроля повышением концентрации полифенолов в 2,3 раза. В случае же с армянскими образцами с учетом дефицита поливочной воды ожидаемое концентрационное повышение антиоксиданта оказалось незначительным и составило для всех образцов в среднем 15 %. При снижении относительной влажности почвы произрастания кукурузы до 34 % у биологического контрольного образца концентрация полифенолов увеличилась в 3,1 раза. Но концентрационные изменения полифе- нолов у образцов армянской популяции оказались неоднозначными. Так, в биологическом материале из населенных пунктов Техут, Шнох и Одзун отмечено повышение общих полифенолов в 2,7 раза, а в случае с Ушакертом - лишь на 15 %. Флавоноиды, особенно производные кверцетина, в значительной степени влияют на движение ауксина на внутриутробном и межклеточном уровнях и, следовательно, жестко регулируют развитие отдельных органов и всего растения [30]. С этой точки зрения практический интерес представляет исследование влияния абиотического стресса, вызванного дефицитом воды на антиоксидантную систему растительного образца по концентрациям флавоноидов. Проведенные эксперименты показали, что во всех биологических материалах численное значение флавоноидов было почти одинаковым, что составляло в среднем около 225 мг Кверцетина/г СВ, за исключением одного из них (см. таблицу). В этом случае ушакертский биологический материал кукурузы содержал на 15 % больше флавоноидов. Вследствие умеренной засухи дефицит воды приводит к повышению содержания флавоноидов у биологического образца В73 в 2,2 раза, а у образцов армянской популяции из населенных пунктов Ушакерт, Шнох, Техут - в полтора раза. Для исследуемого образца из Одзуна установлено, что концентрационные изменения флавоноидов находились в пределах допустимого отклонения от показателя среднего. Как и в предыдущих случаях, здесь также проведено исследование влияния сильной засухи на концентрационные изменения флавоноидов в биологическом материале. Согласно полученным результатам, ответная реакция образцов выражалась в повышении концентрации флавоноидов в них. У биологического контроля В73 сильная засуха приводит к повышению концентрации флавоноидов в 2,6 раза. У исследуемых образцов армянской популяции из населенных пунктов Одзун, Шнох и Техут отмечено увеличение концентрации флавоноидов в среднем в 2,7 раза, а для образцов из Ушакерта - в 1,4 раза. Фактически низкомолекулярные антиоксиданты приводят к повреждению структуры и функции клеток за счет наличия неспаренных электронов в валентной оболочке кислорода. Растительные клетки непрерывно продуцируют АФК даже в нормальных условиях, поддерживая стабильный баланс между производством АФК и защитными механизмами от окислительных повреждений. Абиотический стресс, в первую очередь, нарушает этот баланс, способствуя неконтролируемому всплеску внутриклеточной АФК [31; 32]. Но растительный организм с целью контролирования скорости производства последних «разработал» эффективные ответные механизмы дезактивации АФК, регулирующие такие процессы, как рост растения. Заключение В результате проведенных исследований можно сделать вывод, что антиоксидантная активность в целом у армянских образцов выше, чем у контрольного образца В73. При моделируемой засухе у всех образцов антиоксидантная активность повышается по схожему сценарию: чем сильнее засуха, тем больше кон- центрационные значения всех биохимических показателей. Наблюдаемое отличие в ряду сравнения может быть обусловлено отличием почвенно-климатических регионов произрастания растения.

Об авторах

Астгик Рафиковна Сукиасян

Автор, ответственный за переписку.
Email: sukiasyan.astghik@gmail.com

кандидат биологических наук, доцент факультета химических технологий и природоохранной инженерии Национального политехнического университета Армении

Список литературы