Development of a technique for obtaining bioengineered tubular structures as potential vascular grafts

Alexander S. Zakharov; Захаров А. С.; Ivan N. Vasilovsky; Василовский И. Н.; Natal’ya V. Korotkova; Короткова Н. В.; Nina D. Mzhavanadze; Мжаванадзе Н. Д.; Sergey I. Kalinovsky; Калиновский С. И.; Igor A. Suchkov; Сучков И. А.; Roman E. Kalinin; Калинин Р. Е.

doi:10.22363/2313-0245-2025-29-1-73-83

Development of a technique for obtaining bioengineered tubular structures as potential vascular grafts

Authors: Zakharov A.S.¹^,2, Vasilovsky I.N.¹, Korotkova N.V.¹, Mzhavanadze N.D.¹, Kalinovsky S.I.¹, Suchkov I.A.¹, Kalinin R.E.¹
Affiliations:
1. Ryazan State Medical University
2. Ryazan regional branch of All-Russian society of inventors and innovators
Issue: Vol 29, No 1 (2025): PHYSIOLOGY. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY
Pages: 73-83
Section: PHYSIOLOGY. EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY
URL: https://journals.rudn.ru/medicine/article/view/46814
DOI: https://doi.org/10.22363/2313-0245-2025-29-1-73-83
EDN: https://elibrary.ru/DZSDVK
ID: 46814

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Relevance. The problem of searching for the creation of arterial grafts is relevant in modern vascular surgery, since currently available synthetic prostheses, xeno-, allo- and autographs have a number of disadvantages in practical use: thrombiability, stenosis, inflammation, aneurysmal extensions, etc. The solution to this problem may be the creation of a technology for obtaining bioengineered vascular prostheses based on biocompatible hydrogels. We want to demonstrate the fundamental possibility of developing such a technique in this study. Materials and Methods. At the first stage of the study, the authors used 3D modeling and photopolymer 3D printing technologies in order to manufacture a mold for creating a tissue-engineered vascular prosthesis. At the second stage of the work, the authors developed a technique for heterophase oxidative modification of sodium alginate with peroxynitrite to obtain a cytocompatible hydrogel, which was subsequently tested on human fibroblast culture by analyzing their growth pattern and metabolic activity. At the third stage of the study, a bioengineered tubular structure was created using a previously manufactured mold. Results and Discussion. We have obtained a casting mold for creating a tissue-engineered vascular prosthesis, the distinctive features of which are reusable, collapsible, easy sterilization and ease of operation. The cytocompatibility of the hydrogel obtained by us based on modified sodium alginate has been proved. It is based on a tubular structure with a length of 7 cm, a diameter of 7 mm and a wall thickness of 1 mm. It is shown that it has flexibility, elasticity and resistance to pressure above 300 mmHg. Conclusion. Thus, the authors demonstrated the possibility of obtaining bioengineered tubular structures using 3D printing molding technology and showed the possibility of obtaining and using cytocompatible polysaccharide protein hydrogels for such purposes. The researchers hope that with further improvement of the strength characteristics and adhesive properties of the material, this technique for obtaining bioengineered tubular structures can form the basis for the production technology of vascular grafts for educational, scientific and medical purposes.

Keywords

3D-printing, casting mold, hydrogel, alginate, gelatin, peroxynitrite, vascular graft

Full Text

Введение

Заболевания сосудов в настоящее время привлекают все большее внимание специалистов в области не только клинической, но и фундаментальной медицины. Активно развивающиеся методики реконструктивных оперативных вмешательств на артериальном русле приводят к постоянному совершенствованию сосудистых трансплантатов: синтетических протезов, ауто-, алло- и ксенографтов [1]. Однако множество исследований говорит о существовании целого ряда рисков, связанных с их применением: тромбозов, рестенозов, воспаления, аневризматических расширений и др. [2–4].

Решением проблемы сосудистой трансплантологии может стать создание технологии получения биоинженерных сосудистых графтов на основе биосовместимых гидрогелей [5]. Принципиальную возможность разработки такой методики мы и хотим продемонстрировать в данном исследовании.

Таким образом, целью исследования стала разработка способа получения биоинженерных трубчатых конструкций на основе цитосовместимых гидрогелей при помощи технологии 3D-печати.

Материалы и методы

Изготовление литейной формы

Для формовки трубчатых структур из гидрогелей нами была изготовлена литейная форма. Конструкция формы проектировалась в программе КОМПАС‑3D v20 (Россия).

На основе полученных в ходе проектирования stl-моделей деталей методом фотополимерной 3D-печати при помощи 3D-принтера Anycubic Photon M3 Plus (Китай) были изготовлены детали литейной формы из фотополимерной смолы HarzLabs Industrial Nylon-like (Россия) и HarzLabs Dental Model Light Grey (Россия) при следующих параметрах печати: кол-во базовых слоёв — 2, время засветки слоя — 2 с, время засветки базы — 20 с, пауза между слоями — 9 с, высота подъёма столика — 7 мм, скорость подъёма/опускания столика — 120/180 мм/мин (для Dental Model Light Grey) и кол-во базовых слоёв — 2, время засветки слоя — 1 с, время засветки базы — 10 с, пауза между слоями — 8 с, высота подъёма столика — 7 мм, скорость подъёма/опускания столика — 60/60 мм/мин.

Постобработка напечатанных деталей проводилось в УФ-камере-мойке Anycubic Wash&Cure 3.0 (Китай) при следующих условиях: длительность промывки в изопропиловом спирте — 15 мин, длительность воздействия УФ-облучением — 30 мин.

Окислительная модификация альгината натрия

Альгинат натрия (ALG) (Tianjin Hwashin Biotechnology Co. Ltd., Китай) подвергали окислительной модификации воздействием активной формы кислорода и азота — пероксинитритом в гетерофазных условиях: 4 г порошка альгината натрия заливали смесью 25 мл пероксинитрита и 25 мл 95 % этилового спирта и выдерживали при комнатной температуре и постоянном перемешивании в темноте. Далее осадок отделяли от смеси фильтрацией и проводили через серию растворителей для отделения примесей, образовавшихся в процессе реакции.

Содержание карбонильных, карбоксильных и нитрогрупп определяли методами гидроксиламингидрохлоридного титрования, колориметрически по поглощению абсорбции метиленового синего из раствора и колориметрически реакцией с реактивом Грисса соответственно.

Раствор пероксинитрита для модификации изготавливали реакцией во льду смеси 10 мл 3 % пероксида водорода (Самарамедпром, Россия) с 34 мкл 96 % (масса/объём) серной кислоты (Компонент-Реактив, Россия) и 10 мл 1М раствора нитрита натрия (Уралхим, Россия) с 15 мл 2М раствора гидроксида натрия (Компонент-реактив, Россия). Для разложения избытка пероксида водорода вносили порошок диоксида марганца (Югреактив, Россия). После фильтрации концентрацию пероксинитрита определяли колориметрически на спектрофотометре СФ‑2000 (ОКБ «Спектр», Россия) при длине волны 302 нм ( = 1670).

Получение альгинат-желатиновых гидрогелей

Гидрогели для исследования получали путём растворения в 100 мл физиологического раствора при 40 °C 2 г интактного альгината натрия (ALG) и 3 г желатина (G) (Диа-М, Россия) при постоянном перемешивании с добавлением или без добавления 2 г модифицированного альгината натрия (mALG) в опытный (ALG(2) mALG(2) G(3)) и контрольный (ALG(2) G(3)) гидрогели соответственно.

Клеточное культивирование

В качестве экспериментальной культуры клеток использовали культуру человеческих фибробластов из банка клеток ЦНИЛ РязГМУ, полученную ферментативным методом в 2019 году от здорового донора, подписавшего добровольное информированное согласие. Фибробласты культивировали в культуральных флаконах в среде DMEM/F12 без глутамина и глюкозы с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки и 5 % пенициллин-стрептомицинового антибиотика в условиях CO₂‑инкубатора с 5 % содержанием углекислого газа и температурой 37 °C до состояния монослоя.

Оценка роста фибробластов на поверхности гидрогелей

Изготовленные опытный и контрольный гидрогели заливали в 96‑тилуночный планшет в объёме 60 мкл/лунка, выдерживали до застывания при 4 °C, полимеризовали добавлением 100 мкл 2 % раствора хлорида кальция в течение 10 мин, а затем — 300МЕ микробиальной трансглутаминазы (Biological Co ltd., Китай) в течение всего периода культивирования.

На поверхность гидрогелей высаживали суспензию фибробластов в культуральной среде в концентрации 20 тыс. клеток на лунку. Рост фибробластов оценивали путём фазово-контрастной и светлопольной микроскопии на 3 и 7 дни культивирования при помощи микроскопа Olympus CKX53 (Япония).

Исследование метаболической активности фибробластов на поверхности гидрогелей

Метаболическую активность фибробластов оценивали на 3 и 7 дни культивирования при помощи МТТ-теста: в лунки добавляли 20 мкл раствора МТТ-реактива (Sigma-Aldrich, США) и инкубировали в течение 3 часов. По окончании инкубации среду в лунках заменяли на 100 мкл DMSO и инкубировали еще 30 мин. По окончании инкубации раствор формазана в DMSO из лунок тщательно перемешивали и переносили в чистый 96‑тилуночный планшет. Оптическую плотность определяли на планшетном ридере StatFax 2100 (Awareness Technology, США) в режиме 492/630 нм.

Получение и оценка свойств гидрогелевой трубчатой конструкции

Гидрогелевую трубчатую конструкцию получали на основе отобранного в результате тестов с фибробластами гидрогеля путём заливки гидрогеля в полость литейной формы, полимеризации термически при 4 °C, ионно — 2 % раствором хлорида кальция в течение 10 мин и ферментативно — 10 % раствором микробиальной трансглутаминазы в течение 10 мин.

Полученные в итоге гидрогелевые трубчатые конструкции проверяли путём сгибания и нагнетания давления.

Статистическая обработка данных

Статистический анализ проводили в программе SPSS Statistics v23.0 (IBM, США). Анализ выборок на нормальность не проводился ввиду количества повторностей менее 20, распределение считалось ненормальным. Сравнение пар выборок осуществляли U-критерием Манна–Уитни, для множественных сравнений вначале применяли Н-критерий Краскела-Уоллиса, а затем в качестве апостериорного анализа — U-критерий Манна–Уитни с поправкой Бонферрони.

Результаты и обсуждение

Изготовление литейной формы для получения гидрогелевых трубчатых конструкций

В результате проведенной работы получен патент № 2780293 «Литейная форма для создания тканеинженерного сосудистого протеза» (дата регистрации — 21.09.2022). Конструкция спроектированного и изготовленного нами изобретения представляет собой гантелеобразную структуру, состоящую из 13 деталей 5‑ти типов (Рис. 1).

Литейная форма в собранном состоянии имеет полость длиной 7 см и толщиной 1 мм, соответствующую контурам предполагаемой конструкции трубчатого графта. Гидрогель, заливающийся внутрь конструкции, подвергается сначала холодовой, а затем ионной (путём контакта с 2 % раствором хлорида кальция через отверстия в литейной форме) «сшивке». По окончании данного процесса изобретение может быть разобрано на составные части с высвобождением гидрогелевой трубчатой конструкции, которая далее при необходимости может быть дополнительно подвергнута ферментативной или химической «сшивке».

Рис. 1. Процесс изготовления литейной формы. А — Постобработка деталей различных типов для 4‑хлитейных форм, изготовленных из фотополимерной смолы HarzLabs Industrial Nylon-like. В — внешний вид литейной формы, изготовленной из фотополимерной смолы HarzLabs Dental Model Light Grey, в собранном состоянии
Fig.1. Manufacturing of the casting mold. А — Post-processing of different parts of 4 casting molds made of HarzLabs Industrial Nylon-like photopolymer resin. В — Assembled state of the casting mold made of HarzLabs Dental Model Light Grey photopolymer resin

Получение модифицированного альгината натрия

Путём реакции с полученным 37 мМ раствором пероксинитрита изготовлен образец модифицированного альгината натрия, имевший вид белого порошка с жёлтым оттенком и содержавший увеличенное количество карбонильных, карбоксильных и нитрогрупп, в сравнении с интактным альгинатом натрия (Табл. 1).

Таблица 1
Характеристика полученного образца модифицированного альгината натрия

Вид альгината	Содержание карбонильных групп, %	Содержание карбоксильных групп, %	Содержание нитрогрупп, %
Интактный (ALG)	100	100	0
Модифицированный (mALG)	190 ± 8	157 ± 3.57	5.56 ± 0.64

Table 1
Characteristics of the obtained modified sodium alginate sample

Type of sodium alginate	Carbonylic groups percentage, %	Carboxylic groups percentage, %	Nitro groups percentage, %
Интактный (ALG)	100	100	0
Модифицированный (mALG)	190 ± 8	157 ± 3.57	5.56 ± 0.64

Оценка цитосовместимости гидрогелей с фибробластами

В результате культивирования фибробластов на поверхности модифицированного и контрольного гидрогелей в течение 7 дней установлено, что клетки на гидрогеле ALG(2) G(3) имеют округлую морфологию и склонны объединяться в группы, что может свидетельствовать о недостатке контактов «клетка-матрикс» и избытке контактов «клетка-клетка». В то же время клетки на гидрогеле ALG(2) mALG(2) G(3) распределены по поверхности материала относительно равномерно и имеют вытянутую морфологию, что может говорить о достаточном количестве контактов «клетка-матрикс» и появлении у фибробластов миграционной активности (рис. 2).

Лучшая цитосовместимость модифицированного гидрогеля подтверждается также данными МТТ-теста, согласно которым метаболическая активность фибробластов на поверхности гидрогеля ALG(2) mALG(2) G(3) статистически значимо выше, чем на поверхности ALG(2) G(3) (Рис. 3).

Кроме того, стоит отметить, что, несмотря на различную цитосовместимость и адгезионную способность изготовленных нами гидрогелей, метаболическая активность фибробластов статистически значимо возрастала на каждом из гидрогелей пропорционально срокам культивирования, что говорит о сохранении жизнеспособности клеток и отсутствии цитотоксичности гидрогелевых материалов (Рис. 4).

Рис. 2. Морфология клеточной культуры фибробластов на поверхности гидрогелей. Увеличение Х100. a — гидрогель ALG(2) G(3), b — гидрогель ALG(2) mALG(2) G(3). Клетки на модифицированном гидрогеле контрастированы МТТ-реагентом из-за низкой прозрачности материала
Fig. 2. Morphology of the cell culture on the hydrogel surface. Х100 magnification. a — ALG(2) G(3) hydrogel, b — ALG(2) mALG(2) G(3) hydrogel. Cells on the modified hydrogel are contrasted by the MTT-reagent because of the law transparency of the material

Рис. 3. Метаболическая активность фибробластов на поверхности гидрогелей в различные сроки культивирования

Fig. 3. Metabolic activity of fibroblasts on the surface of hydrogels in different culturing intervals

Рис. 4. Усиление метаболической активности фибробластов с увеличением длительности культивирования на гидрогелях

Fig. 4. Enhancing of metabolic activity of fibroblasts according to the increasing of culturing duration time

Получение и тестирование гидрогелевой трубчатой конструкции

Нами изготовлена гидрогелевая трубчатая конструкция (Рис. 5) длиной 7 см, диаметром 7 мм и толщиной стенки 1 мм, свободно проходимая для жидкостей, выдерживающая сгибание на 180° и полное поперечное пережатие пинцетом, возвращающая свою форму после перечисленных манипуляций. В ходе нагнетания воздуха под давлением (Рис. 6) установлено, что образец способен выдерживать давление выше 300 мм рт. ст.

Рис. 5. Внешний вид биоинженерной гидрогелевой трубчатой конструкции
Fig. 5. Bioengineered hydrogel-based tubular structure

Рис. 6. Тестирование гидрогелевой конструкции на устойчивость к давлению
Рис. 6. Hydrogel-based tubular structure testing for pressure resistance

К настоящему моменту известно множество биоинженерных разработок в области сосудистой хирургии [6–10]. Однако ни один из имеющихся вариантов до сих пор не прошёл полностью доклинические и клинические испытания и не был внедрён в медицинскую практику.

Наиболее ранним подходом к изготовлению подобных сосудистых трансплантатов стала децеллюляризация нативных кровеносных сосудов, получаемых от животных [11–13]. Его преимуществами стали снижение иммуногенности графтов за счёт удаления из них генетически чужеродных человеческому организму клеток, а также наличие большого количества источников получения. Тем не менее, децеллюляризация сосудистых трансплантатов имеет известные недостатки: возможность наличия в составе остатков буферных растворов, ухудшение физических свойств графтов с увеличением длительности децеллюляризации, высокая тромбогенность и невозможность получения сосудистых трансплантатов любых необходимых параметров.

Применение технологий электроспиннинга сосудистых графтов из синтетических полимеров [14–18] выглядело сначала прогрессивным методом, позволяющим создавать трансплантаты различного диаметра, длины и толщины стенки, однако быстро проявились практические недостатки такого подхода: тромбируемость получаемых структур, трудности их заселения эндотелием и фибробластами, высокая пористость и возможность кровоизлияний.

Наиболее перспективным является методом биопечати сосудистых графтов из гидрогелей, заселённых клетками, с использованием биопринтеров [19–22]. Такой подход позволяет получать артериоподобные структуры различной конфигурации и диаметра, а также гарантирует цитосовместимость трансплантата. Недостатками биопечати являются ограниченная площадь печати, высокие требования к вязкостным свойствам гидрогелей-биочернил, цена оборудования и требования к квалификации персонала, а также возможная иммуногенность материала.

Предлагаемый нами в данной работе подход позволяет получать биоинженерные сосудистые графты любых параметров за счёт технологий 3D-моделирования и 3D-печати, применять гидрогели различной вязкости за счёт использования литейных форм и создавать в итоге цитосовместимые конструкции, не придавая им излишнюю пористость. Оценить тромбируемость, иммуногенность и биодеградацию получаемых структур можно будет на этапе испытаний in vivo.

Выводы

В ходе работы нами продемонстрирована возможность получения биоинженерных трубчатых конструкций при помощи технологии формовки с использованием 3D-печати.

Также показана возможность получения и использования цитосовместимых полисахарид-белковых гидрогелей для таких целей.

При дальнейшем совершенствовании прочностных характеристик и адгезивных свойств материала предложенная нами методика получения биоинженерных трубчатых конструкций может лечь в основу технологии производства сосудистых графтов в образовательных, научных и медицинских целях

About the authors

Alexander S. Zakharov

Ryazan State Medical University; Ryazan regional branch of All-Russian society of inventors and innovators

Author for correspondence.
Email: AlexanderZakharov2019@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4004-7474
SPIN-code: 4906-9088
Ryazan, Russian Federation