Development of a technique for obtaining bioengineered tubular structures as potential vascular grafts

Alexander S. Zakharov; Захаров А. С.; Ivan N. Vasilovsky; Василовский И. Н.; Natal’ya V. Korotkova; Короткова Н. В.; Nina D. Mzhavanadze; Мжаванадзе Н. Д.; Sergey I. Kalinovsky; Калиновский С. И.; Igor A. Suchkov; Сучков И. А.; Roman E. Kalinin; Калинин Р. Е.

doi:10.22363/2313-0245-2025-29-1-73-83

Разработка методики получения биоинженерных трубчатых конструкций как потенциальных сосудистых графтов

Авторы: Захаров А.С.¹^,2, Василовский И.Н.¹, Короткова Н.В.¹, Мжаванадзе Н.Д.¹, Калиновский С.И.¹, Сучков И.А.¹, Калинин Р.Е.¹
Учреждения:
1. Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова
2. Рязанское областное отделение общественной организации «Всероссийское общество изобретателей и рационали-заторов»
Выпуск: Том 29, № 1 (2025): ФИЗИОЛОГИЯ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ
Страницы: 73-83
Раздел: ФИЗИОЛОГИЯ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ
URL: https://journals.rudn.ru/medicine/article/view/46814
DOI: https://doi.org/10.22363/2313-0245-2025-29-1-73-83
EDN: https://elibrary.ru/DZSDVK
ID: 46814

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Актуальность. Проблема поиска создания артериальных графтов является актуальной в современной сосудистой хирургии, поскольку имеющиеся в настоящее время синтетические протезы, ксено-, алло- и аутографты имеют ряд недостатков при практическом применении: тромбируемость, стенозирование, воспаление, аневризматические расширения и др. Решением ее может стать создание технологии получения биоинженерных сосудистых протезов на основе биосовместимых гидрогелей. Принципиальную возможность разработки такой методики мы и хотим продемонстрировать в данном исследовании. Материалы и методы . На первом этапе исследования авторы использовали технологии 3D-моделирования и фотополимерной 3D-печати с целью изготовления литейной формы для создания тканеинженерного сосудистого протеза. На втором этапе работы создана методика гетерофазной окислительной модификации альгината натрия пероксинитритом для получения цитосовместимого гидрогеля, протестированного в дальнейшем на культуре человеческих фибробластов путем анализа паттерна их роста и метаболической активности. На третьем этапе исследования при помощи изготовленной ранее литейной формы создана биоинженерная трубчатая конструкция. Результаты и обсуждение . Получена литейная форма для создания тканеинженерного сосудистого протеза, отличительными чертами которой являются многоразовость применения, разборность, простота стерилизации и легкость эксплуатации. Доказана цитосовместимость полученного нами гидрогеля на основе модифицированного альгината натрия. На его основе создана трубчатая конструкция длиной 7 см, диаметром 7 мм и толщиной стенки 1 мм. Показано, что она обладает гибкостью, эластичностью и устойчивостью к давлению свыше 300 мм рт. ст. Выводы . Таким образом, авторы продемонстрировали возможность получения биоинженерных трубчатых конструкций при помощи технологии формовки с использованием 3D-печати и показана возможность получения и использования цитосовместимых полисахарид-белковых гидрогелей для таких целей. Исследователи надеются, что при дальнейшем совершенствовании прочностных характеристик и адгезивных свой ств материала данная методика получения биоинженерных трубчатых конструкций может лечь в основу технологии производства сосудистых графтов в образовательных, научных и медицинских целях.

Ключевые слова

3D-печать, литейная форма, гидрогель, альгинат, желатин, пероксинитрит, сосудистый графт

Полный текст

Введение

Заболевания сосудов в настоящее время привлекают все большее внимание специалистов в области не только клинической, но и фундаментальной медицины. Активно развивающиеся методики реконструктивных оперативных вмешательств на артериальном русле приводят к постоянному совершенствованию сосудистых трансплантатов: синтетических протезов, ауто-, алло- и ксенографтов [1]. Однако множество исследований говорит о существовании целого ряда рисков, связанных с их применением: тромбозов, рестенозов, воспаления, аневризматических расширений и др. [2–4].

Решением проблемы сосудистой трансплантологии может стать создание технологии получения биоинженерных сосудистых графтов на основе биосовместимых гидрогелей [5]. Принципиальную возможность разработки такой методики мы и хотим продемонстрировать в данном исследовании.

Таким образом, целью исследования стала разработка способа получения биоинженерных трубчатых конструкций на основе цитосовместимых гидрогелей при помощи технологии 3D-печати.

Материалы и методы

Изготовление литейной формы

Для формовки трубчатых структур из гидрогелей нами была изготовлена литейная форма. Конструкция формы проектировалась в программе КОМПАС‑3D v20 (Россия).

На основе полученных в ходе проектирования stl-моделей деталей методом фотополимерной 3D-печати при помощи 3D-принтера Anycubic Photon M3 Plus (Китай) были изготовлены детали литейной формы из фотополимерной смолы HarzLabs Industrial Nylon-like (Россия) и HarzLabs Dental Model Light Grey (Россия) при следующих параметрах печати: кол-во базовых слоёв — 2, время засветки слоя — 2 с, время засветки базы — 20 с, пауза между слоями — 9 с, высота подъёма столика — 7 мм, скорость подъёма/опускания столика — 120/180 мм/мин (для Dental Model Light Grey) и кол-во базовых слоёв — 2, время засветки слоя — 1 с, время засветки базы — 10 с, пауза между слоями — 8 с, высота подъёма столика — 7 мм, скорость подъёма/опускания столика — 60/60 мм/мин.

Постобработка напечатанных деталей проводилось в УФ-камере-мойке Anycubic Wash&Cure 3.0 (Китай) при следующих условиях: длительность промывки в изопропиловом спирте — 15 мин, длительность воздействия УФ-облучением — 30 мин.

Окислительная модификация альгината натрия

Альгинат натрия (ALG) (Tianjin Hwashin Biotechnology Co. Ltd., Китай) подвергали окислительной модификации воздействием активной формы кислорода и азота — пероксинитритом в гетерофазных условиях: 4 г порошка альгината натрия заливали смесью 25 мл пероксинитрита и 25 мл 95 % этилового спирта и выдерживали при комнатной температуре и постоянном перемешивании в темноте. Далее осадок отделяли от смеси фильтрацией и проводили через серию растворителей для отделения примесей, образовавшихся в процессе реакции.

Содержание карбонильных, карбоксильных и нитрогрупп определяли методами гидроксиламингидрохлоридного титрования, колориметрически по поглощению абсорбции метиленового синего из раствора и колориметрически реакцией с реактивом Грисса соответственно.

Раствор пероксинитрита для модификации изготавливали реакцией во льду смеси 10 мл 3 % пероксида водорода (Самарамедпром, Россия) с 34 мкл 96 % (масса/объём) серной кислоты (Компонент-Реактив, Россия) и 10 мл 1М раствора нитрита натрия (Уралхим, Россия) с 15 мл 2М раствора гидроксида натрия (Компонент-реактив, Россия). Для разложения избытка пероксида водорода вносили порошок диоксида марганца (Югреактив, Россия). После фильтрации концентрацию пероксинитрита определяли колориметрически на спектрофотометре СФ‑2000 (ОКБ «Спектр», Россия) при длине волны 302 нм ( = 1670).

Получение альгинат-желатиновых гидрогелей

Гидрогели для исследования получали путём растворения в 100 мл физиологического раствора при 40 °C 2 г интактного альгината натрия (ALG) и 3 г желатина (G) (Диа-М, Россия) при постоянном перемешивании с добавлением или без добавления 2 г модифицированного альгината натрия (mALG) в опытный (ALG(2) mALG(2) G(3)) и контрольный (ALG(2) G(3)) гидрогели соответственно.

Клеточное культивирование

В качестве экспериментальной культуры клеток использовали культуру человеческих фибробластов из банка клеток ЦНИЛ РязГМУ, полученную ферментативным методом в 2019 году от здорового донора, подписавшего добровольное информированное согласие. Фибробласты культивировали в культуральных флаконах в среде DMEM/F12 без глутамина и глюкозы с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки и 5 % пенициллин-стрептомицинового антибиотика в условиях CO₂‑инкубатора с 5 % содержанием углекислого газа и температурой 37 °C до состояния монослоя.

Оценка роста фибробластов на поверхности гидрогелей

Изготовленные опытный и контрольный гидрогели заливали в 96‑тилуночный планшет в объёме 60 мкл/лунка, выдерживали до застывания при 4 °C, полимеризовали добавлением 100 мкл 2 % раствора хлорида кальция в течение 10 мин, а затем — 300МЕ микробиальной трансглутаминазы (Biological Co ltd., Китай) в течение всего периода культивирования.

На поверхность гидрогелей высаживали суспензию фибробластов в культуральной среде в концентрации 20 тыс. клеток на лунку. Рост фибробластов оценивали путём фазово-контрастной и светлопольной микроскопии на 3 и 7 дни культивирования при помощи микроскопа Olympus CKX53 (Япония).

Исследование метаболической активности фибробластов на поверхности гидрогелей

Метаболическую активность фибробластов оценивали на 3 и 7 дни культивирования при помощи МТТ-теста: в лунки добавляли 20 мкл раствора МТТ-реактива (Sigma-Aldrich, США) и инкубировали в течение 3 часов. По окончании инкубации среду в лунках заменяли на 100 мкл DMSO и инкубировали еще 30 мин. По окончании инкубации раствор формазана в DMSO из лунок тщательно перемешивали и переносили в чистый 96‑тилуночный планшет. Оптическую плотность определяли на планшетном ридере StatFax 2100 (Awareness Technology, США) в режиме 492/630 нм.

Получение и оценка свойств гидрогелевой трубчатой конструкции

Гидрогелевую трубчатую конструкцию получали на основе отобранного в результате тестов с фибробластами гидрогеля путём заливки гидрогеля в полость литейной формы, полимеризации термически при 4 °C, ионно — 2 % раствором хлорида кальция в течение 10 мин и ферментативно — 10 % раствором микробиальной трансглутаминазы в течение 10 мин.

Полученные в итоге гидрогелевые трубчатые конструкции проверяли путём сгибания и нагнетания давления.

Статистическая обработка данных

Статистический анализ проводили в программе SPSS Statistics v23.0 (IBM, США). Анализ выборок на нормальность не проводился ввиду количества повторностей менее 20, распределение считалось ненормальным. Сравнение пар выборок осуществляли U-критерием Манна–Уитни, для множественных сравнений вначале применяли Н-критерий Краскела-Уоллиса, а затем в качестве апостериорного анализа — U-критерий Манна–Уитни с поправкой Бонферрони.

Результаты и обсуждение

Изготовление литейной формы для получения гидрогелевых трубчатых конструкций

В результате проведенной работы получен патент № 2780293 «Литейная форма для создания тканеинженерного сосудистого протеза» (дата регистрации — 21.09.2022). Конструкция спроектированного и изготовленного нами изобретения представляет собой гантелеобразную структуру, состоящую из 13 деталей 5‑ти типов (Рис. 1).

Литейная форма в собранном состоянии имеет полость длиной 7 см и толщиной 1 мм, соответствующую контурам предполагаемой конструкции трубчатого графта. Гидрогель, заливающийся внутрь конструкции, подвергается сначала холодовой, а затем ионной (путём контакта с 2 % раствором хлорида кальция через отверстия в литейной форме) «сшивке». По окончании данного процесса изобретение может быть разобрано на составные части с высвобождением гидрогелевой трубчатой конструкции, которая далее при необходимости может быть дополнительно подвергнута ферментативной или химической «сшивке».

Рис. 1. Процесс изготовления литейной формы. А — Постобработка деталей различных типов для 4‑хлитейных форм, изготовленных из фотополимерной смолы HarzLabs Industrial Nylon-like. В — внешний вид литейной формы, изготовленной из фотополимерной смолы HarzLabs Dental Model Light Grey, в собранном состоянии
Fig.1. Manufacturing of the casting mold. А — Post-processing of different parts of 4 casting molds made of HarzLabs Industrial Nylon-like photopolymer resin. В — Assembled state of the casting mold made of HarzLabs Dental Model Light Grey photopolymer resin

Получение модифицированного альгината натрия

Путём реакции с полученным 37 мМ раствором пероксинитрита изготовлен образец модифицированного альгината натрия, имевший вид белого порошка с жёлтым оттенком и содержавший увеличенное количество карбонильных, карбоксильных и нитрогрупп, в сравнении с интактным альгинатом натрия (Табл. 1).

Таблица 1
Характеристика полученного образца модифицированного альгината натрия

Вид альгината	Содержание карбонильных групп, %	Содержание карбоксильных групп, %	Содержание нитрогрупп, %
Интактный (ALG)	100	100	0
Модифицированный (mALG)	190 ± 8	157 ± 3.57	5.56 ± 0.64

Table 1
Characteristics of the obtained modified sodium alginate sample

Type of sodium alginate	Carbonylic groups percentage, %	Carboxylic groups percentage, %	Nitro groups percentage, %
Интактный (ALG)	100	100	0
Модифицированный (mALG)	190 ± 8	157 ± 3.57	5.56 ± 0.64

Оценка цитосовместимости гидрогелей с фибробластами

В результате культивирования фибробластов на поверхности модифицированного и контрольного гидрогелей в течение 7 дней установлено, что клетки на гидрогеле ALG(2) G(3) имеют округлую морфологию и склонны объединяться в группы, что может свидетельствовать о недостатке контактов «клетка-матрикс» и избытке контактов «клетка-клетка». В то же время клетки на гидрогеле ALG(2) mALG(2) G(3) распределены по поверхности материала относительно равномерно и имеют вытянутую морфологию, что может говорить о достаточном количестве контактов «клетка-матрикс» и появлении у фибробластов миграционной активности (рис. 2).

Лучшая цитосовместимость модифицированного гидрогеля подтверждается также данными МТТ-теста, согласно которым метаболическая активность фибробластов на поверхности гидрогеля ALG(2) mALG(2) G(3) статистически значимо выше, чем на поверхности ALG(2) G(3) (Рис. 3).

Кроме того, стоит отметить, что, несмотря на различную цитосовместимость и адгезионную способность изготовленных нами гидрогелей, метаболическая активность фибробластов статистически значимо возрастала на каждом из гидрогелей пропорционально срокам культивирования, что говорит о сохранении жизнеспособности клеток и отсутствии цитотоксичности гидрогелевых материалов (Рис. 4).

Рис. 2. Морфология клеточной культуры фибробластов на поверхности гидрогелей. Увеличение Х100. a — гидрогель ALG(2) G(3), b — гидрогель ALG(2) mALG(2) G(3). Клетки на модифицированном гидрогеле контрастированы МТТ-реагентом из-за низкой прозрачности материала
Fig. 2. Morphology of the cell culture on the hydrogel surface. Х100 magnification. a — ALG(2) G(3) hydrogel, b — ALG(2) mALG(2) G(3) hydrogel. Cells on the modified hydrogel are contrasted by the MTT-reagent because of the law transparency of the material

Рис. 3. Метаболическая активность фибробластов на поверхности гидрогелей в различные сроки культивирования

Fig. 3. Metabolic activity of fibroblasts on the surface of hydrogels in different culturing intervals

Рис. 4. Усиление метаболической активности фибробластов с увеличением длительности культивирования на гидрогелях

Fig. 4. Enhancing of metabolic activity of fibroblasts according to the increasing of culturing duration time

Получение и тестирование гидрогелевой трубчатой конструкции

Нами изготовлена гидрогелевая трубчатая конструкция (Рис. 5) длиной 7 см, диаметром 7 мм и толщиной стенки 1 мм, свободно проходимая для жидкостей, выдерживающая сгибание на 180° и полное поперечное пережатие пинцетом, возвращающая свою форму после перечисленных манипуляций. В ходе нагнетания воздуха под давлением (Рис. 6) установлено, что образец способен выдерживать давление выше 300 мм рт. ст.

Рис. 5. Внешний вид биоинженерной гидрогелевой трубчатой конструкции
Fig. 5. Bioengineered hydrogel-based tubular structure

Рис. 6. Тестирование гидрогелевой конструкции на устойчивость к давлению
Рис. 6. Hydrogel-based tubular structure testing for pressure resistance

К настоящему моменту известно множество биоинженерных разработок в области сосудистой хирургии [6–10]. Однако ни один из имеющихся вариантов до сих пор не прошёл полностью доклинические и клинические испытания и не был внедрён в медицинскую практику.

Наиболее ранним подходом к изготовлению подобных сосудистых трансплантатов стала децеллюляризация нативных кровеносных сосудов, получаемых от животных [11–13]. Его преимуществами стали снижение иммуногенности графтов за счёт удаления из них генетически чужеродных человеческому организму клеток, а также наличие большого количества источников получения. Тем не менее, децеллюляризация сосудистых трансплантатов имеет известные недостатки: возможность наличия в составе остатков буферных растворов, ухудшение физических свойств графтов с увеличением длительности децеллюляризации, высокая тромбогенность и невозможность получения сосудистых трансплантатов любых необходимых параметров.

Применение технологий электроспиннинга сосудистых графтов из синтетических полимеров [14–18] выглядело сначала прогрессивным методом, позволяющим создавать трансплантаты различного диаметра, длины и толщины стенки, однако быстро проявились практические недостатки такого подхода: тромбируемость получаемых структур, трудности их заселения эндотелием и фибробластами, высокая пористость и возможность кровоизлияний.

Наиболее перспективным является методом биопечати сосудистых графтов из гидрогелей, заселённых клетками, с использованием биопринтеров [19–22]. Такой подход позволяет получать артериоподобные структуры различной конфигурации и диаметра, а также гарантирует цитосовместимость трансплантата. Недостатками биопечати являются ограниченная площадь печати, высокие требования к вязкостным свойствам гидрогелей-биочернил, цена оборудования и требования к квалификации персонала, а также возможная иммуногенность материала.

Предлагаемый нами в данной работе подход позволяет получать биоинженерные сосудистые графты любых параметров за счёт технологий 3D-моделирования и 3D-печати, применять гидрогели различной вязкости за счёт использования литейных форм и создавать в итоге цитосовместимые конструкции, не придавая им излишнюю пористость. Оценить тромбируемость, иммуногенность и биодеградацию получаемых структур можно будет на этапе испытаний in vivo.

Выводы

В ходе работы нами продемонстрирована возможность получения биоинженерных трубчатых конструкций при помощи технологии формовки с использованием 3D-печати.

Также показана возможность получения и использования цитосовместимых полисахарид-белковых гидрогелей для таких целей.

При дальнейшем совершенствовании прочностных характеристик и адгезивных свойств материала предложенная нами методика получения биоинженерных трубчатых конструкций может лечь в основу технологии производства сосудистых графтов в образовательных, научных и медицинских целях

Об авторах

А. С. Захаров

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова; Рязанское областное отделение общественной организации «Всероссийское общество изобретателей и рационали-заторов»

Автор, ответственный за переписку.
Email: AlexanderZakharov2019@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4004-7474
SPIN-код: 4906-9088
г. Рязань, Российская Федерация