Изучение и анализ резистентности бактерий рода Enterococcus к антибиотикам

Полный текст

Введение Бактерии рода Enterococcus - представители не только типичной кишечной микрофлоры млекопитающих, но также они являются причиной многих заболеваний человека и животных. Среди них такие, как эндокардиты, маститы, метриты, сепсис новорождённых и др. [1]. Патогенность представителей рода Enterococcus неотъемлема от их чувствительности к антибиотикам и связана с наличием детерминант патогенности в одних и тех же носителях генетической информации [2]. На данный момент антибиотикорезистентность энтерококков, выделенных из животных, является серьезной проблемой, поскольку неправильное использование антибактериальных препаратов, а также применение в сельском хозяйстве ампициллина и гентамицина в качестве пищевых добавок для стимуляции роста создает условия для формирования в организме животных резистентных к антибиотикам штаммов энтерококков [3]. Доказано, что антибиотикорезистентные представители рода Enterococcus могут передаваться от заражённых животных к человеку из-за тесного контакта или при употреблении в пищу продуктов животного происхождения [4]. Помимо этого, было обнаружено, что в морской среде представители рода Enterococcus могут передавать свои гены другим видам микроорганизмов, а также возможен совместный перенос генов tet (L) и erm (B), отвечающих за резистентность к тетрациклину и эритромицину [5]. В связи с этим цель данного исследования заключается в изучении и анализе резистентности бактерий рода Enterococcus к антибиотикам, выделенных из водных объектов г. Владивостока. Материалы и методы Было изучено 70 штаммов бактерий рода Enterococcus, выделенных из водной среды с антропогенной нагрузкой на территории г. Владивостока. Было отобрано 20 проб воды в период с 17 января 2018 г. по 27 сентября 2020 г. из водных объектов б. Золотой рог и р. Вторая Речка, так как они находятся в черте города и подвержены сильному антропогенному воздействию. Изучение резистентности определялась диско-диффузным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04. Статистическая обработка данных производилась в программе STATISTICA 10. Графики и таблицы формировались в программе Excel. Результаты Исследование резистентности к антибиотикам бактерий рода Enterococcus, выделенных из б. Золотой Рог, показало, что 56 % чувствительны к тетрациклину, 67 % резистентны к стрептомицину, 56 % резистентны к эритромицину, 100 % чувствительны к ампициллину, 78 % резистентны к левофлоксацину, 89 % чувствительны к рифампицину, 100 % чувствительны к гентамицину, 67 % чувствительны к ванкомицину (табл. 1, рис. 1). Штаммы, выделенные из б. Золотой Рог, имеют повышенный уровень резистентности к левофлоксацину. Также следует отметить повышенный уровень резистентности к тетрациклину и эритромицину. В особенности необходимо уделить вниманию эритромицину, поскольку, по данным исcледователей, выявлена связь между генами, отвечающими за устойчивость к эритромицину (ermB) и меди (tcrB), которая впервые была продемонстрирована на штаммах E. faecalis и E. faecium [6]. Необходимо отметить наличие штаммов с промежуточной устойчивостью к ванкомицину, что позволяет предположить возможность формирования устойчивы к ванкомицину штаммов, что отразится на клиническом значении и роли данных изолятов в лечении инфекций, вызываемых энтерококками. Исследование чувствительности к антибиотикам бактерий рода Enterococcus, выделенных из р. Вторая Речка, показало, что 80 % чувствительны к тетрациклину, 66 % резистентные к стрептомицину, 54 % промежуточно устойчивые к эритромицину, 95 % чувствительны к ампициллину, 86 % чувствительны к левофлоксацину, 72 % резистентные к рифампицину, 100 % чувствительны к гентамицину, 72 % чувствительны к ванкомицину (табл. 2, рис. 2). Таблица 1. Устойчивость к антимикробным химиопрепаратам штаммов рода Enterococcus, выделенных из б. Золотой Рог (n = 9) Название антибиотика Чувствительные Промежуточно устойчивые Резистентные n Процент штаммов, % n Процент штаммов, % n Процент штаммов, % Тетрациклин 5 56 1 11 3 33 Стрептомицин 3 33 0 0 6 67 Эритромицин 3 33 1 11 5 56 Ампициллин 9 100 0 0 0 0 Левофлоксацин 0 0 2 22 7 78 Рифампицин 8 89 0 0 1 11 Гентамицин 9 100 0 0 0 0 Ванкомицин 6 67 3 33 0 0 Table 1. Resistance to antimicrobial chemotherapy drugs of strains of the genus Enterococcus isolated from b. Zolotoy Rog (n = 9) Name of the antibiotic Sensitive Intermediate resistant Resistant n Percentage of strains, % n Percentage of strains, % n Percentage of strains, % Tetracycline 5 56 1 11 3 33 Streptomycin 3 33 0 0 6 67 Erythromycin 3 33 1 11 5 56 Ampicillin 9 100 0 0 0 0 Levofloxacin 0 0 2 22 7 78 Rifampicin 8 89 0 0 1 11 Gentamicin 9 100 0 0 0 0 Vancomycin 6 67 3 33 0 0 Схожий характер устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам штаммов рода Enterococcus наблюдается фактически во всех обследованных водных объектах с антропогенной нагрузкой, за исключением штаммов, выделенных в р. Вторая Речка, где отмечается повышение уровня устойчивых к рифампицину и стрептомицину. А также наличие 3 % штаммов, резистентных к ванкомицину. Изображение выглядит как текст, Параллельный, диаграмма, линия Автоматически созданное описание Рис. 1. Устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам штаммов рода Enterococcus (б. Золотой Рог) Изображение выглядит как текст, Параллельный, типография Автоматически созданное описание Figure 1. Resistance to antibacterial chemotherapy drugs of strains of the genus Enterococcus (b. Zolotoy Rog) Общность характера формирования устойчивости к аминогликозидам и значительную долю резистентных к стрептомицину штаммов позволяет предположить возможность появления ванкомицин устойчивых штаммов энтерококков в ближайшем будущем, что является чрезвычайно актуальным для санитарно-микробиологической и гигиенической характеристики среды пребывания человека. Таблица 2. Устойчивость к антимикробным химиопрепаратам штаммов рода Enterococcus выделенных из р. Вторая Речка (n = 61) Название антибиотика Чувствительные Промежуточно устойчивые Резистентные n Процент штаммов, % n Процент штаммов, % n Процент штаммов, % Тетрациклин 49 80 3 5 9 15 Стрептомицин 7 11 14 23 40 66 Эритромицин 10 16 33 54 18 30 Ампициллин 58 95 0 0 3 5 Левофлоксацин 51 84 6 10 4 6 Рифампицин 11 18 6 10 44 72 Гентамицин 52 87 2 3 6 10 Ванкомицин 44 72 15 25 2 3 Table 2. Resistance to antimicrobial chemotherapy drugs of strains of the genus Enterococcus isolated from the r. Vtoraya Rechka (n = 61) Name of the antibiotic Sensitive Intermediate resistant Resistant n Percentage of strains, % n Percentage of strains, % n Percentage of strains, % Tetracycline 49 80 3 5 9 15 Streptomycin 7 11 14 23 40 66 Erythromycin 10 16 33 54 18 30 Ampicillin 58 95 0 0 3 5 Levofloxacin 51 84 6 10 4 6 Rifampicin 11 18 6 10 44 72 Gentamicin 52 87 2 3 6 10 Vancomycin 44 72 15 25 2 3 Изображение выглядит как текст, Параллельный, диаграмма, линия Автоматически созданное описание Рис. 2. Устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам штаммов рода Enterococcus (р. Вторая Речка) Изображение выглядит как текст, Параллельный, типография Автоматически созданное описание Figure 2. Resistance to antibacterial chemotherapy drugs of strains of the genus Enterococcus (r. Vtoraya Rechka) Однако изучению мультирезистентности или множественной устойчивости к антибиотикам уделяется недостаточно внимание. Поэтому была проанализирована мультирезистентность 70 штаммов рода Enterococcus, выделенных из окружающей среды с антропогенной нагрузкой (б. Золотой Рог и р. Вторая Речка) для 8 антибиотиков разных классов и механизмов действия (тетрациклин, стрептомицин, эритромицин, ампициллин, левофлоксацин, рифампицин, гентамицин и ванкомицин). Было выявлено, что в б. Золотой Рог большинство штаммов рода Enterococcus проявляли устойчивость к трем антибиотикам, что составляло 45 % от всей выборки, к одному и двум - составляло по 22 %. И только 11 % штаммов проявляли устойчивость к четырем антибиотикам, а имено тетрациклину, стрептомицину, эритромицину и рифампицину (рис. 3). Рис. 3. Мультирезистентность бактерий рода Enterococcus к антибиотикам, выделенных из б. Золотой Рог Figure 3. Multiresistance of bacteria of the genus Enterococcus to antibiotics isolated from b. Zolotoy Rog В р. Второй Речке большинство штаммов проявляли резистентность к двум антибиотикам, а именно 41 % выделенных штамов. 20 % были резистентны к трем антибиотикам, 21 % - чувствительны к 6 антибиотикам, 8 % - к четырем антибиотикам и только 2 % к шести антибиотикам. Также следует отметить что было 8 % штаммов, не проявлявших резистентность, однако среди них встречались с промежуточной устойчивостью (рис. 4). В целом выделенные штаммы характеризуются мультирезистентностью по отношению к таким антибиотикам, как стрептомицин, рифампицин и эритромицин, что можно считать отличительной особенностью бактерий рода Enterococcus, выделенного их водных объектов г. Владивостока. При этом в б. Золотой Рог чаще всего встречались штаммы с резистентностью к трем антибиотикам, реже к одному, двум и четырем, а в р. Вторая Речка чаще встречались к двум, реже одному, трем и четырём, однако также встречались чувствительные штаммы и резистентные к восьми антибиотикам. Рис. 4. Мультирезистентность бактерий рода Enterococcus к антибиотикам, выделенных из р. Вторая Речка Figure 4. Multiresistance of bacteria of the genus Enterococcus to antibiotics isolated from the r. Vtoraya Rechka Обсуждение Устойчивость энтерококков к антибиотикам являются одной из основных причин внутрибольничных инфекций [7]. Виды энтерококков, включая наиболее клинически важных представителей этого рода, Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium, являются нормальной микрофлорой желудочно-кишечного тракта человека и поэтому повсеместно встречаются в бытовых сточных водах. Сточные воды могут загрязнять поверхностные и грунтовые воды многими путями, включая неадекватную очистку сточных вод, разливы из-за неисправности или перегрузки инфраструктуры, а также удаление отходов животноводства в водные объекты [8]. Недавние сообщения указывают на то, что слишком много антибиотиков прописывают во всем мире [8; 9]. Например, в США выписывается около 300 миллионов рецептов антибиотиков ежегодно (что эквивалентно более чем 800 рецептам на 1000 человек), и это только для амбулаторного лечения [9]. По оценкам, 30 % этих рецептов антибиотиков были ненужными или несоответствующими, поскольку они были назначены при респираторных заболеваниях, для которых не были показаны (например, вирусные инфекции, бронхит, астма и аллергия, негнойный средний отит) или назначенные антибиотики не соответствовали общепринятым принципам лечения (например, β-лактамы являются терапией первой линии при распространенных бактериальных инфекциях, а азитромицин - наиболее часто назначаемый антибиотик) [9; 10]. Устойчивость микроорганизмов к антимикробным препаратам может быть двух типов. К первому относится врождённая устойчивость, ген которой располагается в хромосоме, а ко второму - приобретённая, ген которой возникает из-за мутаций или появляется при обмене ДНК между бактериями [11]. Тетрациклин обладает бактериостатическим действием, подавляет синтез белка бактериальной клетки на уровне рибосом, а также необратимо связывает металлы (Cu, Fe, Mg, Mn), образуя с ними хелатные соединения и ингибируя ферментные системы [12]. По различным литературным данным, от 60 до 80 % представителей рода Enterococcus имеют резистентностьк тетрациклину [13]. Ген prgQ устойчивости к тетрациклину находится в плазмиде, а его конъюгация стимулируется пептидным ферментом cCF10 [14]. Также у энтерококков было выделено два варианта гена tet, отвечающего за защиту от действия тетрациклина. Первый вариант гена осуществляет защиту путем рибосомальной защиты, включая гены tet (M), tet (O) и tet (S), а второй провоцирует энергозависимый отток тетрациклина из клетки энтерококка и кодируется генами tet (K) и tet (L) [15]. Стрептомицин относится к аминогликозидам, которые действуют бактерицидно на бактериальную клетку, при этом необратимо связываются со специфичными рецепторами бактериальных рибосом и угнетают синтез белка [12]. Поскольку представители рода Enterococcus обладают анаэробным метаболизмом, они практически неустойчивы к малым концентрациям аминогликозидов. Среди клинических изолятов все чаще встречаются энтерококки с генами устойчивости к аминогликозидам [16]. Существует три механизма устойчивости к данным антибиотикам: первый и второй можно объединить, так как они происходят из-за генных мутаций, а третий механизм связан с плазмидами. При первом механизме происходит изменение сайта-мишени, при втором - изменения в транспорте антибиотика, а третий - происходит путем ферментативной дезактивации аминогликозидов [17]. Устойчивость к стрептомицину может быть связана как с мутацией рибосомного белка, так и с ферментативным расщеплением последнего [16]. Эритромицин относится к макролидам и обладает бактериостатическим действием, что проявляется в подавлении синтеза белка микробной клетки на уровне рибосом и связано с угнетением фермента пептидтранслоказы [12]. Существует два основных механизма, приводящих к устойчивости к макролидам: первый с помощью рибосомальной метилазы, которая кодируется геном erm, а второй - благодаря действию, опосредованному мембраносвязанным эффлюксным белком, кодирующимся генами mef (A или E) и msr (M) [18]. По литературным данным выявлена связь между генами, отвечающими за устойчивость к эритромицину (ermB) и меди (tcrB), которая впервые была продемонстрирована на штаммах E. faecalis и E. faecium, выделенных от свиней, позже показали подобную связь у E. hirae, который был выделен из морской воды [6]. Ампициллин - это β-лактамный антибиотик, имеющий бактериостатическое действие [12]. Подавляет синтез клеточной стенки бактерий, связываясь с пенициллинсвязывающими белками, которые являются ферментами, ответственными за формирование структуры клеточной стенки [19]. Замены, которые ранее считались способствующими развитию устойчивости к ампициллину в клинических штаммах, при экспрессии плазмидным pbp5 в чувствительном к нему хозяине E. faecium давали умеренные уровни устойчивости, тем самым обеспечивая прямое доказательство их влияния. Комбинации точечных мутаций, особенно Pbp5 M485A с вставкой Ser в положении 466, давали существенно повышенные уровни устойчивости. Кроме того, была установлена корреляция между сродством очищенных рекомбинантных мутантов Pbp5 к связыванию антибиотиков с уровнями устойчивости, обеспечиваемыми этими аллелями. Дальнейший анализ показал, что хромосомно-кодируемый детерминант pbp5 может передаваться между штаммами E. faecium [20] путем конъюгации, что предполагает механизм, с помощью которого высокая устойчивость к ампициллину, обеспечиваемая мутантными аллелями pbp5, может распространяться среди клинических изолятов [21]. Подобно E. faecium, мутации в Pbp5 клинических изолятов E. faecalis могут также приводить к повышенной устойчивости к бета-лактамным антибиотикам, таким как ампициллин [22]. Левофлоксацин - это фторхинолон с бактерицидным действием, обладает выраженной противомикробной активностью за счет ингибирования двух ключевых ферментов клетки, отвечающих за биосинтез и репликацию ДНК: ДНК-гиразы и топоизомеразы IV [23]. Считается, что мутации в областях, определяющих устойчивость к хинолонам gyrA, кодирующей ДНК-гиразу, и parC, кодирующей ДНК-топоизомеразу IV, системы оттока, антимикробных ферментов устойчивости и плазмид-опосредованных механизмов, способствуют устойчивости к фторхинолонам [24]. Исследования факторов риска устойчивости к фторхинолонам при энтерококковых инфекциях мочевых путей продемонстрировали, что недавнее воздействие антибиотиков, таких как фторхинолоны, цефалоспорины широкого спектра действия и клиндамицин, в значительной степени связано с устойчивостью к фторхинолонам энтерококковых уропатогенов, включая E. faecalis и E. faecium [25]. Рифампицин относится к группе макролактамных антибиотиков, имеет бактерицидное действие и проявляется в подавлении синтеза РНК путем образования комплекса с ДНК-зависимой РНК-полимеразой [12]. Изучение E. faecium показало, что 78,9 % энтерококков являются резистентными к рифампицину. Большинство микроорганизмов, включая энтерококки, вырабатывают резистентность путем мутаций в гене rpoB, который кодирует β-субъединицу РНК-полимеразы, существуют и другие механизмы устойчивости к рифампицину, однако они встречаются редко [26]. Гентамицин является аминогликозидом с бактерицидным действием [12]. Аминогликозиды действуют путем связывания с 16S рРНК 30S субъединицы рибосомы и препятствуют синтезу белка. Энтерококки обычно проявляют умеренный уровень внутренней устойчивости к аминогликозидам, что объясняется плохим усвоением антибиотиков. Анализ выбранных мутантов, которые проявляли повышенную устойчивость к гентамицину in vitro, показал, что нарушение усвоения гентамицина может непосредственно способствовать усилению устойчивости [27]. Ванкомицин - антибактериальный химиопрепарат, относящийся к гликопептидам с бактерицидным действием, при котором нарушается синтез клеточной стенки [12]. У микроорганизмов существует пять фенотипов резистентности к ванкомицину: VanA, VanB, VanC, VanD и VanE. Первые, два из которых стали выделять в последние время, хотя до этого не выделяли, у E. faecalis и E. faecium [28]. В исследовании 1988 г. впервые упоминаются резистентные к ванкомицину штаммы E. faecalis и E. faecium. После этого их стали выделять все чаще в различных больницах [29]. В исследовании энтерококков госпитализированных и негоспитализированных лиц показало, что E. faecium имеет большую устойчивость к ванкомицину по сравнению с E. faecalis [29-30]. В России данная проблема не столь актуальна, однако, чтобы избежать негативного опыта других стран, необходимо сократить применение данного антибиотика и повысить санитарно-гигиенические меры во избежание энтерококковых инфекций. Выводы Было выявлено, что в б. Золотой Рог более половины выделенных штаммов обладали резистентностью к стрептомицину, эритромицину и левофлоксацину, а в р. Вторая Речка более 50 % штаммов - стрептомицину и рифампицину. Выделенная популяция штаммов энтерококков характеризовалась мультирезистентностью к двум антибиотикам (41 %) в р. Вторая Речка и трем или более антибиотикам (45 %) в б. Золотой. Чаще всего встречалась резистентность к сочетанию таких антибиотиков, как стрептомицин, рифампицин и эритромицин.

Об авторах

Светлана Сергеевна Ускова

Дальневосточный федеральный университет

Email: uskova.ss@yandex.com
ORCID iD: 0000-0001-7515-1207
SPIN-код: 2127-7799

аспирант, Институт Мирового океана

690922, Российская Федерация, Приморский край, г. Владивосток, о. Русский, п. Аякс, 10

Алина Викторовна Мартынова

Дальневосточный федеральный университет

Email: clinmicro@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6823-5971
SPIN-код: 1842-1670

доктор медицинских наук, профессор кафедры биоразнообразия и морских биоресурсов, Институт Мирового океана

690922, Российская Федерация, Приморский край, г. Владивосток, о. Русский, п. Аякс, 10

Александра Вячеславовна Ким

Дальневосточный федеральный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: kim-sandra@mail.ru
кандидат биологических наук, старший преподаватель каф. биоразнообразия и морских биоресурсов, Институт Мирового океана 690922, Российская Федерация, Приморский край, г. Владивосток, о. Русский, п. Аякс, 10

Список литературы