Bioaccumulation of bacteriophages T4 and RB43 by freshwater bivalves in sterile aquarium water

Maria K. Bulavina; Булавина Мария Константиновна; Tatiana N. Abashina; Абашина Татьяна Николаевна; Nataliya E. Suzina; Сузина Наталья Егоровна; Valentina N. Polivtseva; Поливцева Валентина Николаевна; Andrei A. Zimin; Зимин Андрей Антонович

doi:10.22363/2313-2310-2025-33-1-7-20

Биоаккумуляция бактериофагов Т4 и RB43 пресноводными двустворчатыми моллюсками в стерильной аквариумной воде

Авторы: Булавина М.К.¹, Абашина Т.Н.¹, Сузина Н.Е.¹, Поливцева В.Н.¹, Зимин А.А.¹
Учреждения:
1. Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
Выпуск: Том 33, № 1 (2025)
Страницы: 7-20
Раздел: Экология
URL: https://journals.rudn.ru/ecology/article/view/43653
DOI: https://doi.org/10.22363/2313-2310-2025-33-1-7-20
EDN: https://elibrary.ru/AEMDOT
ID: 43653

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Изучена биоаккумуляция бактериофагов T4 и RB43 двустворчатыми моллюсками U. pictorum и A. cygnea . Проведены тесты на содержание E. coli в моллюсках и сравнение активности биоаккумуляции вирусов в зависимости от корма. Выявлено, что бактериофаги T4 и RB43, несмотря на различия условий и строение вируса, показывают сходную модель биоаккумуляции, где их титр зависит от активности моллюска и меняется циклами. Бактериофаг размножается за счет естественной микрофлоры животного и может удерживаться им благодаря фильтрационному типу питания. На активность моллюска также влияют особенности кормления.

Ключевые слова

бактериофаги, Escherichia virus T4, Escherichia phage RB43, биоаккумуляция, двустворчатые моллюски

Полный текст

Введение Биоаккумуляция - процесс накопления живыми организмами различных веществ, при котором животное быстрее поглощает вещество, чем оно выводится из него. Особую опасность представляет аккумулирование вирусов в живых организмах, особенно в тех, которые употребляются в пищу. Двустворчатые моллюски могут служить организмами-аккумуляторами для обнаружения вирусных патогенов, так как они уже успешно применяются при мониторинге химического и биологического загрязнения [1]. В качестве модели биоаккумуляции вирусов могут использоваться бактериофаги. Их численность коррелируется с вирусной; они являются показателем фекального загрязнения воды, и их можно применять в качестве индикатора кишечных вирусов в пище [2]. Они легко обнаруживаются в воде в больших концентрациях, а численность можно отследить с помощью посева [3]. Бактериофаги влияют на численность бактерий, их эволюцию и горизонтальный перенос генетического материала между ними [4]. Фаги могут влиять на микрофлору моллюсков, перенося различные гены между бактериями благодаря трансдукции. Все эти факторы подтолкнули нас к подробному изучению биоаккумуляции фагов моллюсками. Материалы и методы Опыты проводились на Unio pictorium (перловица обыкновенная) (Linnaeus, 1758) и Anodonta cygnea (беззубка обыкновенная) (Linnaeus, 1758), принадлежащих к семейству Unionidae, отряду Unionida, классу двустворчатых или пластинчатожаберных моллюсков (Bivalvia) [5]. Моллюски имели размеры: U. pictorium 6,8-7,5 см в длину, A. cygnea достигали 8,3-9 см (рис. 1). Моллюски были отобраны в р. Ока около г. Пущино в мае-августе 2023 г. и содержались в условиях, приближенных к естественным. Моллюски проживали в стеклянных аквариумах объемом 15-40 л с аэрацией в течение 1-8 мес. (риc. 2). ба Рис. 1. Раковины моллюсков, используемых в опытах: а - U. Pictorium; б - A. cygnea Источник: фотографии М.К. Булавиной, Т.Н. Абашиной, Н.Е. Сузиной, В.Н. Поливцевой, А.А. Зимина. Figure 1. Shells of mollusks used in experiments: a - U. pictorium; б - A. cygnea Source: photo by M.K. Bulavina, T.N. Abashina, N.E. Suzina, V.N. Polivtseva, A.A. Zimin. Изображение выглядит как аквариум, черно-белый, окно, монохромный Автоматически созданное описание Рис. 2. Временное содержание U. pictorium и A. cygnea в аквариуме с уровнем воды 30 см: 1 - перловицы; 2 - беззубки; 3 - фильтр аэр-лифт; 4 - дополнительная аэрация Источник: фотографии М.К. Булавиной, Т.Н. Абашиной, Н.Е. Сузиной, В.Н. Поливцевой, А.А. Зимина. Figure 2. Temporary holding of U. pictorium and A. cygnea in the aquarium with water level of 30 cm: 1 - U. pictorium; 2 - A. cygnea; 3 - Filter air-lift; 4 - Additional aeration Source: photo by M.K. Bulavina, T.N. Abashina, N.E. Suzina, V.N. Polivtseva, A.A. Zimin. Кормление моллюсков производили детритом или разбавленной культурой Chlorella vulgaris, входящий в порядок - Chlorellales семейство - Chlorellaceae род - Chlorella (Beijerinck, 1890) [6]. Каждый из моллюсков был помещен в стакан с 200 мл воды из аквариума, где они ранее проживали. Среда была автоклавирована под давлением 0,05-0,2 МПа. Стерильность воды проверялась с помощью посева на среду LB. Вода аэрировалась с помощью воздушного компрессора, что воссоздавало привычные условия обитания и позволяло равномерно распределить фаги в воде (рис. 3). Рис. 3. U. pictorium в экспериментальных условиях: 1 - нога моллюска; 2 - воздушный компрессор; 3 - стакан; 4 - сифон; 5 - раковина. Открытие сифона моллюском указывает на благоприятные для него условия Источник: фотографии М.К. Булавиной, Т.Н. Абашиной, Н.Е. Сузиной, В.Н. Поливцевой, А.А. Зимина. Figure 3. U. pictorium in experimental conditions: 1 - clam leg; 2 - air compressor; 3 - glass; 4 - siphon; 5 - shell Source: photo by M.K. Bulavina, T.N. Abashina, N.E. Suzina, V.N. Polivtseva, A.A. Zimin. После открытия раковины добавлялась суспензия фага в исходной концентрации 1×103 или 1×104 БОЕ/мл в количестве 2 мл. Пробы воды в объеме 1 мл отбирались после внесения суспензии фагов с помощью стерильной пипетки и пробирки сразу и через 1, 3, 6, 24 ч. Позже были добавлены пробы через 5, 15 и 30 мин, 48 и 72 ч. Образцы отбирались в трех повторностях. Все образцы титровались по методу Грациа, вносились на среду LB на чашки Петри и культивировались в течение ночи при 37 °С, после чего производился подсчет образовавшихся бляшек и вычислялось среднее значение для каждой пробы. Эксперименты проводились с бактериофагами Escherichia virus T4 и RB43. Фаг T4 дикого типа не способен осуществлять трансдукцию, однако мутанты способны к трансдукции. Природные псевдо-Т-четные бактериофаги, такие как RB43, содержат цитозин, а значит, способны к трансдукции плазмид [7; 8]. Бактериофаг T4 несет на поверхности своего каписида основной антиген, белок Hoc, который играет роль в связывании фага с различными полимерными гликозидами биологического происхождения. Белок Hoc T4 имеет три иммуноглобулиноподобных домена, экспонированных на поверхности капсида и участвующих в связывании гликозидов. Белок Hoc фага RB43 короткий и не имеет иммуноглобулин подобных доменов. Hoc фага Т4 имеет сходство с белком «воротничка» Wac фага RB43, вероятно также обеспечивающим адгезивность. Белок Wac RB43 имеет последовательности, сходные со вторым доменом Hoc [9]. Количественно данных доменов адгезивности примерно в 23 раза меньше. В работе мы предполагали проверить, повлияет ли это на биоаккумуляцию фагов двустворчатыми моллюсками. Фаги получали, используя штамм Escherichia coli B. В качестве контроля использовалась стерильная вода из аквариума, в которую вносилась суспензия фага в той же концентрации и объеме; пробы отбирались по схеме, представленной выше. Бляшки фагов, выросших при титровании проб, контролировали с помощью ПЦР-реакций, специфичных к конкретным бактериофагам. Проведены тесты на содержание E. coli как в моллюсках, так и в среде. Для обнаружения E. coli в моллюсках U. pictorum и A. cygnea также помещались в те же условия, описанные выше. Пробы отбирались через 30 мин, 1 и 2 ч, затем вносились на среду LB в количестве 20 или 200 мкл и культивировались в течение ночи при 37 °C. Затем производился подсчет колоний. Результаты исследований Можно отметить наиболее часто встречающиеся особенности биоаккумуляции. Распространено повышение титра спустя час, в этот момент начинается активное размножение бактериофага. Часто формируются плато, где активность моллюска минимальна и титр фага почти не меняется. Титр часто снижается спустя сутки и далее, что может говорить об удержании моллюском фага, по большей части это встречается в опытах с перловицей, вероятно, этот вид моллюска более предрасположен к накоплению фага. Однако встречается и повышение титра спустя сутки, но гораздо реже (рис. 4, табл.). Для нетрансдуцирующего бактериофага Т4 характерны высокие концентрации, что является показателем более активного размножения. Также можно заметить, что фаг Т4 не так активно циркулирует в воде, как трансдуцирующий фаг RB43, значения титра которого в воде заметно различаются. Однако RB43 сохраняет достаточно низкие концентрации при большом разбросе значений, что может говорить о том, что активность его размножения гораздо ниже, чем у Т4 (рис. 5). Эта тенденция сохраняется и при выращивании фага в культуре LB. Опыты проводились в открытой системе, и можно заметить схожий механизм циркуляции фага в среде и моллюске. Титр изменяется циклически, в зависимости от активности моллюска, который попеременно всасывает и выпускает порцию воды с взвесью бактериофагов. Изображение выглядит как линия, диаграмма, График, текст Автоматически созданное описание Рис. 4. Усредненные показатели изменения титра в зависимости от времени в одном из экспериментов с Т4 и A. cygnea Источник: составлено М.К. Булавиной, Т.Н. Абашиной, Н.Е. Сузиной, В.Н. Поливцевой, А.А. Зиминым. Figure 4. The average of the titer changes as a function of time in one of the experiments with T4 and A. cygnea Source: compiled by M.K. Bulavina, T.N. Abashina, N.E. Suzina, V.N. Polivtseva, A.A. Zimin. Изменение титра Т4 в одном из экспериментов с A. cygnea в зависимости от времени в трех разных точках Фаг Т4 Титр фага в пробах в разных промежутках времени от начала опыта 0 ч 5 мин 15 мин 30 мин 1 ч 3 ч 6 ч 24 ч Титр в разных точках, БОЕ/мл 46 66 8 56 68 31 37 64 47 21 34 80 53 41 21 33 64 72 8 57 42 33 39 60 Среднее значение 5,3×102 5,3×102 1,7×102 6,4×102 5,4×102 3,5×102 3,3×102 5,2×102 Источник: составлено М.К. Булавиной, Т.Н. Абашиной, Н.Е. Сузиной, В.Н. Поливцевой, А.А. Зиминым. Change in the titer of T4 over time at three different points during the experiment with A. cygnea Phage Т4 The titer of phage in samples at different time intervals from the beginning of the experiment 0 h 5 min 15 min 30 min 1 h 3 h 6 h 24 h Titer at Different Time Points, PFU/ml 46 66 8 56 68 31 37 64 47 21 34 80 53 41 21 33 64 72 8 57 42 33 39 60 Expectation value 5.3×102 5.3×102 1.7×102 6.4×102 5.4×102 3.5×102 3.3×102 5.2×102 Source: compiled by M.K. Bulavina, T.N. Abashina, N.E. Suzina, V.N. Polivtseva, A.A. Zimin. Изображение выглядит как линия, диаграмма, текст, График Автоматически созданное описание Рис. 5. Усредненные показатели изменения титра в зависимости от времени в одном из экспериментов с RB43 и A. cygnea Источник: составлено М.К. Булавиной, Т.Н. Абашиной, Н.Е. Сузиной, В.Н. Поливцевой, А.А. Зиминым Figure 5. Mean titer changes over time in one of the RB43 and A. cygnea experiments Source: compiled by M.K. Bulavina, T.N. Abashina, N.E. Suzina, V.N. Polivtseva, A.A. Zimin. Проведены посевы на наличие E. coli в среде и моллюсках, где зафиксировали не только наличие бактерии, но и корреляцию с опытами по биоаккумуляции. При посеве проб объемом 20 мкл рост часто полностью отсутствовал, что может служить показателем того, что в среде нет бактерий; однако при посеве проб объемом 200 мкл рост наблюдался. Тем не менее в обоих случаях рост все еще достаточно низкий. Видимо, E. coli находится в среде и моллюсках в небольшом количестве. В случае пробы объемом 200 мкл можно проследить постепенное повышение титра спустя 30 мин и 1 ч от начала эксперимента. Скорее всего, именно в это время моллюск выпускает жидкость. Однако спустя 2 ч от начала опыта титр снижается в обоих случаях. Скорее всего, в это время моллюск вновь всасывает воду вместе с взвесью бактерий. Если сравнивать с экспериментами по биоаккумуляции, можно предположить, что активность фагов часто повышается где-то в промежутке 1-3 ч от начала эксперимента (рис. 6). В естественной микрофлоре моллюска присутствуют E. coli, за счет которых идет размножение фагов в воде и моллюске. Содержание количества E. сoli в среде зависит от активности самого моллюска и частоты выброса взвеси бактерий с ней в среду. Микрофлора каждого моллюска уникальна, чем можно объяснить различия в результатах. Титр фага в контроле не сильно изменялся, но падал к концу эксперимента. Похоже фаг начинает сорбироваться на стенках стакана спустя 24 ч, что коррелирует с результатами опытов с моллюсками (рис. 7). АИзображение выглядит как линия, График, диаграмма Автоматически созданное описание БИзображение выглядит как линия, График, диаграмма Автоматически созданное описание Рис. 6. Изменение титра E. сoli, входящей в естественную микрофлору моллюска в зависимости от времени: А - проба 20 мкл; Б - проба 200 мкл Источник: составлено М.К. Булавиной, Т.Н. Абашиной, Н.Е. Сузиной, В.Н. Поливцевой, А.А. Зиминым. Figure 6. Changes in the titer of E. coli entering the natural microflora of the mollusk over time: A - 20 mL sample; B - 200 mL sample Source: compiled by M.K. Bulavina, T.N. Abashina, N.E. Suzina, V.N. Polivtseva, A.A. Zimin. Изображение выглядит как текст, линия, График, диаграмма Автоматически созданное описание Рис. 7. Усредненные показатели изменения титра в зависимости от времени в контроле в одном из экспериментов с Т4 Источник: составлено М.К. Булавиной, Т.Н. Абашиной, Н.Е. Сузиной, В.Н. Поливцевой, А.А. Зиминым. Figure 7. Mean titer changes over time in the control group during one of the T4 experiments Source: compiled by M.K. Bulavina, T.N. Abashina, N.E. Suzina, V.N. Polivtseva, A.A. Zimin. На активность моллюска могут влиять и особенности кормления (рис. 8). Изображение выглядит как линия, диаграмма, График Автоматически созданное описание Рис. 8. Усредненные показатели изменения титра Т4 в зависимости от особенностей кормления, влияющей на активность U. pictorium: а - кормление разбавленной культурой Ch. vulgaris; б - кормление детритом Источник: составлено М.К. Булавиной, Т.Н. Абашиной, Н.Е. Сузиной, В.Н. Поливцевой, А.А. Зиминым. Figure 8. Average changes of the titer of T4 depending on feeding characteristics, affecting the activity of U. pictorium: a - feeding with diluted Ch. vulgaris culture; b - feeding with detritus Source: compiled by the M.K. Bulavina, T.N. Abashina, N.E. Suzina, V.N. Polivtseva, A.A. Zimin. На графике усредненных показателей изменения титра в зависимости от времени в одном из экспериментов с Т4 и A. сygnea (см. рис. 4) можно заметить выделяющиеся циклы: титр спустя час повышался, затем спустя три часа понижался, а через 6 и 24 ч сохранялась такая же динамика. На втором графике эта особенность выражена не так ярко: спустя час титр фага возрастал, затем спустя три часа падал, но далее только немного вырос к концу опыта. В случае кормления разбавленной культурой Ch. vulgaris моллюски проявляли большую активность; фазы были более отчетливыми, и моллюск всасывал и выбрасывал большие количества воды. В 2020 г. было опубликовано первое подобное исследование в данной области [10]. При сравнении можно заметить определенные сходства: благодаря естественной микрофлоре моллюска, где находилась E. coli, происходило размножение фага. Также наблюдались циклы, когда титр фагов попеременно возрастал и падал с течением времени. Однако между проведенными исследованиями мы также выявили определенные различия. Например, титр фагов увеличивался спустя более продолжительное время после начала эксперимента - от 3 до 24 ч. Повышение титра в первый час после начала опыта не наблюдалось. Хотя циклы прослеживались, они не были так ярко выражены, как в предыдущем исследовании. Заключение Эксперименты по аккумуляции фагов двустворчатыми моллюсками показали, что изменения в титре бактериофагов связаны с фильтрационным типом питания моллюска и, возможно, с наличием в его микрофлоре бактерий E. coli. Несмотря на сходство результатов экспериментов, циркуляция фагов в моллюске и окружающей среде может различаться в зависимости от конкретного животного из-за уникальной микрофлоры каждого моллюска. Можно наблюдать схожую цикличность изменения титра фагов во времени с чередующимися периодами снижения и увеличения титра вируса. Можно сделать вывод, что механизм биоаккумуляции фагов у различных двустворчатых моллюсков имеет сходные особенности. Хотя можно отметить более частые колебания титра фага при биоаккумуляции трансдуцирующего бактериофага RB43 A. cygnea, что может быть связано и с меньшим молекулярным потенциалом связывания гликозидов внутренней слизи моллюска у этого фага по сравнению с нетрансдуцирующим бактериофагом Т4. Критичного влияния расположения и копийности белков адгезинов Нос фага T4 и Wac RB43 на их биоаккумуляцию двустворчатыми моллюсками мы не обнаружили. Возможно, шести троек иммуноглобулинподобных доменов адсорбции на поверхности частицы фага в основном достаточно для участия в процессе биоаккумуляции. В контроле, где в стерильную воду из аквариума добавлялся фаг, титр несильно изменялся, но падал к концу эксперимента. Возможно, фаг сорбируется на стенках стакана спустя 24 ч, что коррелирует с результатами опытов с моллюсками. На активность моллюска влияет особенность кормления: в случае кормления разбавленной культурой Ch. vulgaris моллюски проявляли большую активность; фазы были более отчетливыми, и моллюск всасывал и выбрасывал большие количества воды.