Опухолевые модели в изучении патогенеза и разработке методов лечения рака полости рта

Полный текст

Введение

Рак полости рта (РПР) является одним из самых распространенных видов рака среди новообразований головы и шеи и характеризуется плохим прогнозом и отсутствием специфических биомаркеров. Основными факторами риска развития РПР являются употребление табака и алкоголя, воспаление, наличие вируса папилломы человека (ВПЧ) и плоского лишая полости рта [1]. РПР считается заболеванием пожилых людей, однако в последние годы наблюдается активный рост заболеваемости в молодом возрасте [2]. Этиологические факторы, характерные для РПР в старшей возрастной категории, не всегда ассоциированы с данным заболеванием в молодом возрасте. Предполагается, что РПР у молодых пациентов является отдельной клинической формой и характеризуется специфической этиологией и патогенезом [3, 4].

Для понимания биологии развития РПР необходимы актуальные модельные системы. На сегодняшний день модели для исследования РПР прошли путь от клеточных культур до систем in vivo, которые имитируют патологические процессы и взаимодействие опухоли и стромы. Но все еще существует потребность в разработке новых модельных систем для понимания молекулярных и генетических механизмов возникновения и развития РПР и оценки эффективности новых терапевтических и профилактических стратегий [5].

Получение клеточных моделей рака полости рта

Получение клеточных линий из опухолей пациентов является распространенным подходом в моделировании и изучении злокачественных новообразований. В банке ATCC (American Type Culture Collection) представлены доступные аутентифицированные иммортализованные линии опухолей миндалин (UWO37 (HPV16), HNO41), языка (UWO23, SCC‑25, HNO97, HNO223, CAL 27), подчелюстной железы (A64-CLS) и карциномы полости рта (CLS‑354, HNO258). Однако только половина из перечисленных клеточных линий РПР использовалась для разработки терапевтических стратегий, открытия мишеней или оценки химиочувствительности и химиорезистентности [6–12]. Модели in vitro позволяют провести скрининг эффективности новых противоопухолевых веществ и оценки систем доставки стандартных химиопрепаратов. Одним из примеров является разработка новой формы доксорубицина — доксила, при скрининге которого было показано значительное снижение пролиферации клеток РПР [9]. Модельные системы in vitro позволяют модифицировать стандартные схемы лечения и подобрать новые. Так, на моделях in vitro была показана эффективность применения радиосенсибилизаторов для лучевой терапии РПР [10]. Все вышеупомянутые данные, полученные на иммортализованных клеточных линиях, послужили основой для дальнейших экспериментов на более сложных моделях in vivo.

В отличие от иммортализованных культур первичные линии, полученные из операционного материала, являются более релевантной моделью в виду эффективного сохранения опухолевой гетерогенности. Первичные линии эпителиальных клеток РПР получены из слизистой оболочки щеки, слизистой оболочки десны, языка, приносовых пазух и грушевидной ямки [13]. Данные модели позволяют воссоздать опухоль-стромальные взаимодействия, имитирующие микроокружение опухоли. Чаще всего первичные культуры используют для оценки эффективности новых терапевтических подходов с целью дальнейшей трансляции лечения в онкологическую практику.

При получении первичных линий РПР чаще всего используют ферментативный и эксплантационный методы. При эксплантационном методе клетки мигрируют из ткани на культуральный пластик через 48 часов после помещения в среду, тогда как при ферментативном подходе клетки из полученной суспензии адгезируют в течение 12 часов. При обоих методах выявляются как эпителиальные, так и фибробластоподобные клетки в полученной культуре. Тем не менее, ферментативный метод демонстрирует большую эффективность по выходу клеток и требует меньше времени [14].

Генетические изменения иммортализованных и первичных клеточных линий с помощью систем CRISPR-Cas, TALLEN и siRNA позволяют изучать функциональную значимость генов, открывать новые маркеры и терапевтические мишени. Так, при РПР нокаут гена LRP1B привел к повышенной пролиферации и миграции и способствовал развитию устойчивости к химио- и радиотерапии [6]. Нокдаун FAT1 и CASP8 в первичной культуре РПР усилил пролиферацию и миграцию клеток, что привело к ускоренному росту первичной культуры плоскоклеточной карциномы полости рта за счет повышения пролиферации [15]. Таким образом, выявленные функциональные значения генетических нарушений являются основой в разработке лекарственных препаратов и диагностических и прогностических маркеров РПР.

Канцерогенез — это многоэтапный процесс, для изучения которого необходимы более сложные трехмерные модели in vitro, имитирующие ткани in vivo. К таким моделям относятся сфероиды, или культивируемые свободно плавающие агрегаты опухолевых клеток, и органоиды, представляющие собой миниатюрные версии органов, полученные из стволовых клеток [16]. Трехмерные модели позволяют с большей эффективностью разрабатывать и оценивать новые терапевтические решения [17–19]. Так, применение органоидов, состоящих из клеток РПР (дно рта, язык и альвеолярный отросток) и соответствующего нормального эпителия, выявило различную чувствительность на стандартные схемы лечения — химиотерапию цисплатином, карбоплатином и цетуксимабом и лучевую терапию. Ответ органоидов на воздействие химиолучевой терапии был сопоставим с реакцией пациентов на аналогичную терапию в 26% случаев. Кроме того, использование клеточных сфероидов РПР позволило выбрать новые таргетные препараты, которые в настоящий момент находятся на I и II фазах клинических испытаний: эверолимус, нирапариб, алпелисиб и вемурафениб [20].

Таким образом, модельные системы in vitro представляют собой эффективный инструмент для изучения биологии опухолей полости рта и оценки эффективности терапии за счет высокой воспроизводимости и скорости получения результатов.

Животные модели рака полости рта

Животные модели, как и модели in vitro, широко используются для исследования РПР (рисунок 1) [21–25]. Модели РПР разработаны на иммунокомпетентных и иммуносупрессивных грызунах. РПР у мышей может быть вызван трансплантацией опухолевых клеток (ксенографт или аллографт) и химическим канцерогеном, преимущественно 4‑нитрохинолин 1‑оксидом [26].

Существующие клеточные линии РПР (SCC7, MOC, MOC1, MOC2) используются для разработки сингенных моделей [27–30]. Сингенные модели на иммунокомпетентных мышах позволяют провести первичный анализ фармакологических свой­ств тестируемых химических соединений. Для доклинических исследований используют более сложную биологическую модель — иммуносупресивных мышей с дальнейшей перевивкой человеческих опухолевых клеток (ксеногенные модели). Первичные и постоянные клеточные линии, трансплантированные мышам подкожно для установки гетеротопической модели, легко контролировать на предмет размера опухоли и реакции на терапевтическое воздействие [5]. Однако мыши с иммунодефицитом не могут в полной мере отражать взаимодействие опухоли с ее микроокружением из-за отсутствия полноценного иммунного ответа. Кроме того, ксенографты характеризуются высокой скоростью пролиферации клеток, что не позволяет фиксировать промежуточные стадии заболевания [5].

Рис. 1. Актуальные модели РПР
Fig. 1. Current models of oral cancer

При моделировании РПР in vivo опухолевые клетки вводят в слизистую оболочку щеки, мышцы языка или дно полости рта (ортотопическая модель) [21]. Мышиные модели РПР используются в разработке новых подходов в таргетной и иммунной терапии, оценки химиорезистентности и открытии новых мишеней [31–36]. На моделях in vivo показана эффективность сочетанного действия облучения и иммунотерапии, которое значительно тормозило рост опухоли и улучшало общую выживаемость мышей с ксенографтами РПР по сравнению с группой контроля [31]. Одним из примеров разработки таргетных препаратов является доклиническое исследование MEDI0641 — конъюгата антитела с лекарственным средством, нацеленного на онкофетальный антиген 5T4. Однократное введение конъюгата вызывало регрессию ксенографтов РПР у мышей [32].

В экспериментальной онкологии помимо иммуносупресивных и иммунокомпетентных животных используют генетически модифицированных и гуманизированных мышей [37]. Генетически модифицированные мышиные модели (GEMM) получены путем индукции (нокинга) или удаления (нокаута) определенных генов [38]. С использованием GEMM изучена роль генов PIK3CA, EGFR, TP53 и CDK‑4 в патогенезе РПР [39–41]. Тем не менее, GEMM имеют определенные ограничения из-за неконтролируемой экспрессии трансгенов и распространения опухоли за пределы ротовой полости.

Гуманизированные мыши используются в качестве трансляционных моделей во многих областях экспериментальной онкологии, включая клинические исследования, и представляют собой животных с иммунодефицитом, которым привиты иммунные человеческие клетки. Для создания функциональной иммунной системы человека используют два основных источника человеческих клеток: мононуклеары периферической крови или CD34⁺ гемопоэтические стволовые клетки. Иммунный компонент вводят внутривенно или внутрибрюшинно, и далее ортотопически прививают опухолевые клетки. Чаще всего, гуманизированных мышей используют при моделировании лейкемии из-за высокой приживаемости данных опухолевых клеток [42]. В литературе крайне редко встречаются упоминания использования гуманизированных мышей при РПР. Например, модель гуманизированных мышей с ВПЧ-ассоциированным раком языка была разработана для дальнейшей доклинической оценки эффективности терапевтических подходов ВПЧ-положительного РПР [43].

Описаны также модели РПР на крысах, хомяках и кошках [44–46]. РПР у кошек развивается спонтанно, у крыс под воздействием 4‑нитрохинолин 1‑оксида. Модель защечного мешка хомяка является традиционным высоковоспроизводимым подходом для поиска новых терапевтических стратегий, который был разработан еще в 50‑е годы прошлого столетия [21, 46]. Канцероген 4‑нитрохинолин 1‑оксид наносится в растворе на поверхность слизистой оболочки защечного пространства и позволяет оценить поэтапные изменения в ряду норма — предрак — рак [47].

Таким образом, модели in vivo эффективны в доклинических исследованиях: лабораторные животные используются во второй фазе при разработке лекарственных средств и являются переходным этапом к клиническим испытаниям.

Выводы

Понимание молекулярных механизмов РПР имеет решающее значение в разработке новых методов лечения данного заболевания. Использование клеточных линий позволяет обнаружить новые этиологические и патогенетические факторы заболевания и провести анализ фармакологических свой­ств химических соединений. Модели in vivo эффективны в разработке новых терапевтических стратегий в лечении РПР. Тем не менее, при планировании исследований важно учитывать ограничения и недостатки моделей in vitro и in vivo и выбирать наиболее корректные, основываясь на их преимуществах и экспериментальных задачах.

Об авторах

М. С. Третьякова

Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: trremar@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5040-931X
SPIN-код: 5207-8330
г. Томск, Российская Федерация

Е. А. Простакишина

Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук

Email: trremar@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1405-3723
SPIN-код: 4517-4433
г. Томск, Российская Федерация

Е. С. Колегова

Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук

Email: trremar@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9122-3274
SPIN-код: 5865-1264
г. Томск, Российская Федерация

Е. Л. Чойнзонов

Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук

Email: trremar@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3651-0665
SPIN-код: 2240-8730
г. Томск, Российская Федерация

Е. В. Денисов

Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук

Email: trremar@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2923-9755
SPIN-код: 9498-5797
г. Томск, Российская Федерация

Список литературы

Дополнительные файлы