Иммунопатогенетические особенности геморрагической лихорадки с почечным синдромом как критерии ранней иммунодиагностики

Полный текст

Введение

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) — острое вирусное заболевание природно-­очагового характера, сопровождающееся развитием лихорадочного, геморрагического синдромов, гемодинамическими нарушениями, а также острым повреждением почек [1]. Возбудители ГЛПС относятся к роду ортохантавирусов, более 28 видов которых причастны к этиологии данной инфекции у человека [2]. Среди них — Orthohantavirus puumalaense (ортохантавирус Пуумала), который играет основную роль в структуре заболеваемости ГЛПС в России и на долю которого приходится 97,7 % случаев этого заболевания [3]. Внимание современных исследователей к ГЛПС обусловлено высокой вероятностью тяжелого течения и возможностью летального исхода заболевания, его природноочаговым характером, затрудняющим эпидемиологическую борьбу с ним, длительностью периода восстановления после инфекции, отсутствием этиотропной терапии, низкой эффективностью вакцинопрофилактики, тенденцией к использованию ортохантавирусов в качестве биологического оружия [3–6].

Источником геморрагической лихорадки с почечным синдромом, вызываемой Orthohantavirus puumalaense, для человека чаще всего являются грызуны [7], передача возбудителя человеку обычно происходит при вдыхании пыли, содержащей контаминированные вирусом экскременты грызунов [8]. От человека к человеку эта вирусная инфекция не передается, а начальным местом репликации ортохантавируса являются дыхательные пути [3, 9]. ГЛПС имеет циклическое течение и включает несколько клинических периодов: лихорадочный с преобладанием явлений цитокинового шторма, нарушений гемодинамики и геморрагического синдрома продолжительностью от 3‑х до 7 дней, олигоурический, протекающий на фоне острого повреждения почек и выраженной олигоурии (6–12 дней), полиурический период, проявляющийся переходом от олигоурии к полиурии (6–14 дней), реконвалесценции продолжительностью до 2‑х месяцев и более [5, 8]. В патогенезе заболевания подчеркивается ведущая роль иммунной системы, что связано с очень широким спектром клеточных мишеней для ортохантавирусов, в число которых входят, наряду с эндотелиальными, эпителиальными клетками и тромбоцитами, макрофаги, дендритные клетки, лимфоциты, нейтрофилы, имеющие непосредственное отношение к развитию иммунного ответа [9].

Давая характеристику особенностям иммунных процессов при ГЛПС, авторы одного из обзоров подчеркивают особое значение в иммунопатогенезе этого заболевания, вызванного ортохантавирусом Пуумала, таких лимфоцитов как натуральные киллеры и CD8⁺ цитотоксические лимфоциты. Отмечается значение для выздоровления при ГЛПС формирования CD8⁺ Т-клеточной памяти, детали механизмов развития которой авторы оценивают как неизвестные. Указывается на значение регуляторных клеток, в том числе CD4⁺, хотя авторы отмечают, что их значительный рост при данном заболевании не зарегистрирован [10]. При этом одним из существенных недостатков в исследовании иммунного статуса при ГЛПС, на наш взгляд, является игнорирование постадийного течения этого заболевания со сменой ведущих патогенетических механизмов, что требует обязательного учета этого обстоятельства в виде дифференцированного подхода к оценке иммунопатогенеза на разных этапах ГЛПС.

Существуют и другие проблемы, требующие учета специфики заболевания. Несмотря на то, что в диагностике этой инфекции используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР), а также методы серодиагностики (реакция непрямой иммунофлуоресценции или непрямой иммуноферментный анализ), возникает проблема ранней диагностики ГЛПС из-за отсутствия цитопатического эффекта и довольно медленного цикла репликации ортохантавируса Пуумала, что приводит к поздней виремии на 5–10 день после заражения [8, 11] и, следовательно, низкой информативности ПЦР в первые дни заболевания, в то время как диагностически значимая сероконверсии наступает примерно после 5‑го дня от начала клинических проявлений [12].

В наших предыдущих публикациях было показано, что уже на ранних этапах ГЛПС возникает целый ряд довольно характерных сдвигов со стороны иммунного статуса, в частности, высокий уровень экспрессии цитотоксическими Т-лимфоцитами (CD8⁺) лектиновых рецепторов С-типа NKG2D, а также довольно значительная и нехарактерная для большинства острых инфекций доля CD4⁺ и CD8⁺ регуляторных Т-клеток среди лимфоцитов крови [13]. Взаимосвязь этих сдвигов (практически не изученных при инфекциионных процессах) именно с ортохантавирусной инфекцией нуждается в дополнительных доказательствах, по крайней мере, требует сравнения с другими вирусными инфекциями желательно с тем же (респираторным) механизмом передачи.

В соответствии с этими сведениями целью исследования является оценка иммунофенотипического состава лимфоцитов и цитокинового профиля в крови пациентов с геморрагической лихорадкой с почечным синдромом в сравнении с острыми респираторными вирусными инфекциями и с перспективой разработки иммунологических критериев для ранней диагностики ГЛПС.

Материалы и методы

Нами наблюдались пациенты с верифицированным диагнозом геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) среднетяжелого и тяжелого течения, которые проходили лечение в Инфекционном отделении № 1 Клиник Самарского государственного медицинского университета с 2017 по 2022 годы. 24 пациента поступили в стационар на 2–4‑й день болезни, то есть находились под наблюдением начиная с лихорадочного периода ГЛПС, они составили основную группу исследования.

Пациенты группы сравнения № 1 на первой неделе заболевания находились в том же стационаре и включали 18 человек, поступивших с подозрением на ГЛПС в период сезонного роста встречаемости этого заболевания (осенне-­зимний период). У 7 человек впоследствии методом ПЦР была диагностирована аденовирусная инфекция, у 5 человек — грипп, у 4 больных — риновирусная инфекция, у 2 пациентов — респираторно-­синцитиальная вирусная инфекция. Основанием для включения этих больных в группу сравнения послужила вирусная природа заболевания при аэрогенном пути заражения (ОРВИ), а также наличие клинических и лабораторных признаков лихорадочного и общетоксического инфекционного синдрома среднетяжелого и тяжелого течения, что и определяло возможность их сопоставления с ГЛПС.

Группа сравнения № 2 состояла из 15 клинически здоровых доноров крови Самарской областной клинической станции переливания крови.

От всех обследованных лиц получено информированное согласие на участие в исследовании, а программа исследований одобрена на заседании этического комитета Самарского государственного медицинского университета (протокол № 204 от 11.12.2019).

Все три группы примерно соответствовали друг другу по полу и возрасту. Во всех группах преобладали женщины, на их долю в основной группе приходились 62,5 %, в группе сравнения № 1 — 67 %, в группе сравнения № 2 — 60 %, а средний возраст составлял соответственно 42,2  ±  12,1 лет, 43,4 ± 11,2 лет, 40,6  ±  14,9 лет.

У всех пациентов, вошедших в исследование, осуществлялось фенотипирование лимфоцитов на 2–5‑й день от начала заболевания, а в группе сравнения № 2 — по мере обращения. Фенотипическое исследование лимфоцитов проводилось методом проточной цитофлуориметрии с использованием цитофлуориметра BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) после автоматизированной пробоподготовки цельной крови с помощью станции автоматической пробоподготовки BD FACS Sample Prep Assistant II (Becton Dickinson, США) в соответствии с инструкцией по применению приборов и моноклональных антител.

Было проведено изучение абсолютного и относительного числа клеток среди лимфоцитов (CD45⁺) крови следующих фенотипов: CD19⁺ (В-лимфоциты); CD3⁺ (Т-лимфоциты); СD3⁺CD4⁺ (Т-хелперы); СD3⁺CD8⁺ (цитотоксические Т-лимфоциты, или ЦТЛ); СD3⁺CD4⁺FoxP3⁺ (СD4⁺ регуляторные Т-клетки); СD3⁺CD8⁺FoxP3⁺ (СD8⁺ регуляторные Т-клетки); CD3⁺CD56⁺ (НКТ-подобные клетки); CD3-СD16⁺CD56⁺ (натуральные киллеры, или НК); CD3⁺CD25⁺ (Т-лимфоциты, экспрессирующие рецептор активации CD25); CD3⁺CD8⁺CD314⁺ (ЦТЛ, экспрессирующие рецептор активации NKG2D); CD16⁺CD56⁺CD314⁺ (НК, экспрессирующие рецептор активации NKG2D).

Для определения перечисленных показателей использовались меченные моноклональные антитела (МКАТ) производства BD Biosciences (США). Расчет абсолютных величин показателей проводился по формуле:

Так же проводилось исследование уровней интерлейкинов (ИЛ)-4, –1β, –6, –10, –12, факторов некроза опухолей α и β (ФНОα и ФНОβ), интерферона γ (ИФНγ) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием планшетного фотометра «OPSYS MR» фирмы «THERMOLABSYSTEMS» (Финляндия) в соответствии с инструкцией по применению аппаратуры и комплектов соответствующих моноклональных антител производства Вектор Бест (Россия).

Cтатистическая обработка данных проводилась на основе пакета статистических программ SPSS (версия 23). Использовались методы дескриптивной и сравнительной непараметрической статистики, корреляционный анализ, рассчитывался 95 % доверительный интервал показателей. Соотношение чувствительности и специфичности тестов устанавливалось методом линейной регрессии с построением ROC-кривой и расчетом площади под кривой — AUC.

Результаты и обсуждение

Для реализации поставленной цели проводился анализ содержания в крови лимфоцитов всех намеченных фенотипов у 24 пациентов ГЛПС в лихорадочный период (первые 2–5 дней от начала заболевания) в сравнении с пациентами с острой респираторной вирусной инфекцией в этот же период от начала заболевания (18 человек).

Предварительное определение общего содержания лейкоцитов в крови больных ГЛПС и ОРВИ показало их статистически значимое (р < 0,05) превышение показателей у здоровых людей (6,9 ± 1,9 * 106 клеток/л) при соответствии этих данных в обеих группах пациентов с вирусными инфекциями (соответственно 11,4 ± 4,8 *106 клеток/л и 10,5 ± 2,7 *106 клеток/л, p = 0,697). Определение процента лимфоцитов среди лейкоцитов крови выявило достоверное снижение этого показателя в группах ГЛПС (16,4 ± 5,2 %) и ОРВИ (18,9 ± 8,1 %) по сравнению с группой здоровых людей (29,0 ± 5,7 %), в то время как между собой данные по группам вирусных инфекций статистически значимо не различались (р = 0,211).

Эти данные позволили при выявлении фенотипических различий лимфоцитов по группам исследования ограничиться анализом только относительных, но не абсолютных величин. Результаты такого анализа представлены в таблице 1. Статистический анализ в связи с отсутствием нормального распределения данных осуществлялся методами непараметрической статистики с использованием критерия Манна-­Уитни, различия считались статистически значимыми при р < 0,05.
Оценивая перечень наблюдаемых сдвигов со стороны фенотипического состава лимфоцитов при сравнении групп ГЛПС и ОРВИ, следует подчеркнуть, что среди этих сдвигов отчетливо преобладают не столько базовые показатели иммунограмм, сколько набор тех оригинальных фенотипов, что были введены нами для оценки фенотипического профиля лимфоцитов в данном исследовании.

Среди сдвигов со стороны фенотипов лимфоцитов, широко тестируемых в составе базовых иммунограмм и выявляющих достоверные различия между группами ГЛПС и ОРВИ, в данном исследовании следует отметить рост доли В-лимфоцитов в обеих группах вирусных инфекций, более выраженный при ГЛПС, а также максимальное нарастание процента натуральных киллеров при ОРВИ и менее значительный рост при ГЛПС, хотя сравнение по всем трем группам исследования носят статистически достоверный характер.

Таблица 1 Относительное содержание в крови лимфоцитов разных фенотипов на ранних этапах ГЛПС и в группах сравнения

Фенотипические показатели лимфоцитов (%)	Медиана (минимум; максимум)			p1 p2 p3
	Пациенты с ГЛПС, n = 24	Пациенты с ОРВИ, (группа сравнения 1) n = 18	Здоровые люди (группа сравнения 2) n = 15
В‑лимфоциты, CD19+	13.6 (5.0; 25.0)	11.3 (6.9; 17.4)	10.5 (2.5; 15.7)	0,039* 0,044* 0,046*
Т‑лимфоциты, CD3+	68.0 (49.7; 87.0)	73.5 (52.0; 89.5)	75.0 (62.0; 87.0)	0,338 0,053 0,881
Активированные Т‑лимфоциты, CD3+CD25+	4.8 (1.1; 27.0)	4.0 (1.6; 7.4)	7.5 (2.6; 7.8)	0,026* 0,164 0,707
Т‑хелперы, CD3+CD4+	36.8 (16.0; 67.0)	40.0 (20.5; 61.2)	41.0 (14.0; 57.0)	0,737 0,289 0,858
Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), CD3+CD8+	26.0 (10.4; 78.0)	28.3 (13.3; 37.5)	28.0 (16.0; 71.0)	0,950 0,754 0,929
NKG2D+ ЦТЛ, CD3+CD8+CD314+	30.6 (8.3; 58.9)	21.8 (10.2; 31.5)	12.6 (9.6; 27.0)	0,031* <0,001*** 0,003**
CD4+ регуляторные Т-клетки, CD3+CD4+FoxP3+	10.7 (4.9; 16.3)	7.7 (5.0; 18.0)	3.05 (2.3; 8.1)	0,034* <0,001*** 0,044*
CD8+ регуляторные Т‑клетки, CD3+CD8+FoxP3+	13.0 (3.5; 23.9)	7.3 (6.2; 23.0)	0.45 (0.1; 4.4)	0,008** <0,001*** 0,001**
НКТ‑подобные клетки, CD3+CD56+	4.7 (1.5; 30.6)	5.0 (2.3; 20.0)	3.4 (2.3; 5.0)	0,231 0,169 0,233
Натуральные киллеры (НК), СD16+CD56+	17.0 (7.7; 53.0)	21.5 (4.0; 34.4)	12.9 (9.5; 27.7)	0,022* 0,001** 0,049*
NKG2D+ НК, CD16+CD56+CD314+	6.7 (1.0; 16.3)	10.4 (1.0; 15.0)	9.6 (7.7; 21.6)	0,068 0,118 0,254

Примечание: n — количество человек в группе; р₁ — вероятность различий показателей в группах ГЛПС и здоровых людей; р₂ — вероятность различий показателей в группах ОРВИ и здоровых людей; р₃ — вероятность различий показателей в группах ГЛПС и ОРВИ; достоверность различий по критерию Манна-У итни: * при р < 0,05, ** при р<0,01, *** при р < 0,001.

Table 1 Relative blood abundance of different phenotype lymphocytes in the early stages of HFRS and in comparison groups

Lymphocyte phenotypic parameters (%)	Median (minimum; maximum)			p1 p2 p3
	HFRS рatients n = 24	ARVI рatients (comparison group 1) n = 18	Healthy people (comparison group 2) n = 15
B cells, CD19+	13.6 (5.0; 25.0)	11.3 (6.9; 17.4)	10.5 (2.5; 15.7)	0.039* 0.044* 0.046*
Т cells, CD3+	68.0 (49.7; 87.0)	73.5 (52.0; 89.5)	75.0 (62.0; 87.0)	0.338 0.053 0.881
Activated Т cells, CD3+CD25+	4.8 (1.1; 27.0)	4.0 (1.6; 7.4)	7.5 (2.6; 7.8)	0.026* 0.164 0.707
T helper cells, CD3+CD4+	36.8 (16.0; 67.0)	40.0 (20.5; 61.2)	41.0 (14.0; 57.0)	0.737 0.289 0.858
Cytotoxic T-lymphocytes (CTLs), CD3+CD8+	26.0 (10.4; 78.0)	28.3 (13.3; 37.5)	28.0 (16.0; 71.0)	0.950 0.754 0.929
NKG2D+ CTLs, CD3+CD8+CD314+	30.6 (8.3; 58.9)	21.8 (10.2; 31.5)	12.6 (9.6; 27.0)	0.031* <0.001*** 0.003**
CD4+ regulatory T cells, CD3+CD4+FoxP3+	10.7 (4.9; 16.3)	7.7 (5.0; 18.0)	3.05 (2.3; 8.1)	0.034* <0.001*** 0.044*
CD8+ regulatory T cells, CD3+CD8+FoxP3+	13.0 (3.5; 23.9)	7.3 (6.2; 23.0)	0.45 (0.1; 4.4)	0.008** <0.001*** 0.001**
NКТ‑like cells, CD3+CD56+	4.7 (1.5; 30.6)	5.0 (2.3; 20.0)	3.4 (2.3; 5.0)	0.231 0.169 0.233
Natural killer cells (NK), CD3–СD16+CD56+	17.0 (7.7; 53.0)	21.5 (4.0; 34.4)	12.9 (9.5; 27.7)	0.022* 0.001** 0.049*
NKG2D+ NК, CD16+CD56+CD314+	6.7 (1.0; 16.3)	10.4 (1.0; 15.0)	9.6 (7.7; 21.6)	0.068 0.118 0.254

Note: n — the number of persons in the group; p1 — probability of differences in HFRS and healthy people groups; p2 — probability of differences in ARVI and healthy people groups; p3 — probability of differences in HFRS and ARVI groups; significance of Mann-­Whitney differences: * at p<0.05, ** at p<0.01, *** at p < 0.001.

Для оценки критериального и прогностического значения выявленной категории сдвигов проводилось определение 95 %‑х доверительных интервалов указанных показателей и построение ROC-кривых (рис. 1).

Как следует из рисунка 1, 95%-й доверительный интервал процентного содержания В-лимфоцитов в крови при величине выше 12,6 % свидетельствует о принадлежности пациента к группе геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Построение ROC-кривой показывает, что этот скрининговый тест имеет высокое прогностическое значение, поскольку площадь под ROC-кривой (AUC) составляет в данном случае 0,878, то есть выше 0,8, что в случае клинических исследований следует оценивать именно таким образом [14].

При тестировании натуральных киллеров ситуация иная. 95%-й доверительный интервал для ГЛПС занимает промежуточное положение между двумя группами сравнения (группой ОРВИ и группой клинически здоровых людей). В результате при построении ROC-кривой AUC составляет всего 0,454, то есть данный скриниинговый тест прогностического значения вообще не имеет.

Что касается остальных показателей, использованных для оценки фенотипического профиля ГЛПС на самых ранних стадиях инфекционного процесса впервые, то к ним относились NKG2D⁺ цитотоксические Т-лимфоциты (CD3⁺CD8⁺CD314⁺) и регуляторные Т-клетки с фенотипами CD3⁺CD4⁺FoxP3⁺ и CD3⁺CD8⁺FoxP3⁺. Результаты анализа прогностического значения этих лимфоцитов представлены на рис. 2.

Графики показывают, что все три показателя обладают очень высокой прогностической значимостью, поскольку площадь под ROC-кривой (AUC) имела значения выше 0,8.

Например, относительное число цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих активирующий лектиновый рецептор NKG2D, в крови при значениях выше 25 % с высокой прогностической значимостью (AUC = 0,863) и при наличии соответствующих клинических проявлений позволяло предположить наличие у пациента геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Аналогичное предположение позволяли сделать значения процентного содержания среди лимфоцитов крови CD4+ регуляторных Т-клеток выше 7,8 % (AUC = 0,963), а также CD8⁺ регуляторных Т-клеток выше 9,5 % (AUC = 0,899).

Рис. 1. 95 % доверительные интервалы процентов В-лимфоцитов и натуральных киллеров среди лимфоцитов крови в группах исследования и ROC-кривые их прогностического значения
Fig. 1. 95 % confidence intervals of B cell and natural killer cell percentages among blood lymphocytes in the study groups
and ROC curves of their prognostic value

Рис. 2. 95 % доверительные интервалы процентов NKG2D⁺ ЦТЛ, СD4⁺ и CD8⁺ регуляторных Т-клеток среди лимфоцитов крови в группах исследования и ROC-кривые их прогностического значения
Fig. 2. 95 % confidence intervals of NKG2D⁺ CTL, СD4⁺ and CD8⁺ regulatory T cell percentages among blood lymphocytes in the study groups and ROC curves of their prognostic value

Для более точной расшифровки механизма участия названных клеток в патогенезе ранних стадий ГЛПС проводился анализ уровней цитокинов провоспалительного и противовоспалительного действия в первые 2–5 дней развития ГЛПС, результаты которого представлены в таблице 2.

Таблица 2 Уровни провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови на ранних этапах ГЛПС и в группах сравнения

Тестируемые цитокины (пг/мл)	Медиана (минимум; максимум)			p1 p2 p3
	Пациенты с ГЛПС n = 24	Пациенты с ОРВИ (группа сравнения 1) n = 18	Здоровые люди (группа сравнения 2) n = 15
ИЛ‑4	1,5 (1,5; 1,8)	2,0 (1,6; 2,8)	2,2 (1,3; 4,2)	0,002** 0,284 0,013*
ИЛ‑12	12,1 (10,9; 13,7)	12,0 (9,5; 12,7)	9,1 (7,8; 14,4)	0,036* 0,041* 0,918
ИФНγ	86,5 (72,2; 101,0)	81,4 (76,1; 119,7)	40,8 (27,5; 51,5)	<0,001*** 0,004** 0,703
ИЛ‑1β	2,4 (2,0; 2,9)	2,6 (2,1; 3,0)	3,8 (2,50; 5,2)	0,003** 0,008** 0,237
ИЛ‑6	25,9 (20,0; 32,3)	20,6 (16,2; 28,0)	6,2 (2,7; 9,2)	<0,001*** 0,003** 0,047*
ФНОα	3,0 (2,7; 3,9)	2,9 (2,60; 3,4)	2,0 (0,8; 2,8)	0,021* 0,043* 0,513
ФНОβ	52,3 (48,0; 82,1)	48,4 (45,1; 55,6)	1,4 (0,6; 2,9)	<0,001*** <0,001*** 0,041*
ИЛ‑10	14,8 (11,2; 40,5)	9,0 (7,5; 25,2)	6,8 (3,4; 9,1)	<0,001*** 0,005** 0,026*

Примечание: n — количество человек в группе; р₁ — вероятность различий показателей в группах ГЛПС и здоровых людей; р₂ — вероятность различий показателей в группах ОРВИ и здоровых людей; р₃ — вероятность различий показателей в группах ГЛПС и ОРВИ; достоверность различий по критерию Манна-Уитни: * при р<0,05, ** при р < 0,01, *** при р < 0,001.

Table 2 Serum levels of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in the early stages of HFRS and in comparison groups

Cytokines tested (pg/mL)	Median (minimum; maximum)			p1 p2 p3
	HFRS рatients n = 24	ARVI рatients (comparison group 1) n = 18	Healthy people (comparison group 2) n = 15
IL-4	1,5 (1,5; 1,8)	2,0 (1,6; 2,8)	2,2 (1,3; 4,2)	0,002** 0,284 0,053
IL-12	12,1 (10,9; 13,7)	12,0 (9,5; 12,7)	9,1 (7,8; 14,4)	0,036* 0,041* 0,918
IFNγ	86,5 (72,2; 101,0)	81,4 (76,1; 119,7)	40,8 (27,5; 51,5)	<0,001*** 0,004** 0,703
IL-1β	2,4 (2,0; 2,9)	2,6 (2,1; 3,0)	3,8 (2,50; 5,2)	0,003** 0,008** 0,237
IL-6	25,9 (20,0; 32,3)	20,6 (16,2; 28,0)	6,2 (2,7; 9,2)	<0,001*** 0,003** 0,047*
TNFα	3,0 (2,7; 3,9)	2,9 (2,60; 3,4)	2,0 (0,8; 2,8)	0,021* 0,043* 0,513
TNFβ	52,3 (48,0; 82,1)	48,4 (45,1; 55,6)	1,4 (0,6; 2,9)	<0,001*** <0,001*** 0,041*
IL-10	14,8 (11,2; 40,5)	9,0 (7,5; 25,2)	6,8 (3,4; 9,1)	<0,001*** 0,005** 0,026*

Note: n — the number of persons in the group; p₁ — probability of differences in HFRS and healthy people groups; p₂ — probability of differences in ARVI and healthy people groups; p₃ — probability of differences in HFRS and ARVI groups; significance of Mann-Whitney differences: * at p<0.05, ** at p<0.01, *** at p<0.001.

Как следует из таблицы 2, статистически достоверные сдвиги у пациентов с ГЛПС и с ОРВИ по сравнению с группой здоровых людей демонстрируют практически все тестированные цитокины, кроме ИЛ‑4 у больных ОРВИ. Однако различия между показателями в группах ГЛПС и ОРВИ отмечены только для 3 цитокинов — ИЛ‑6, ФНОβ, ИЛ‑10.

Для оценки прогностического значения более выраженного роста уровней этих цитокинов у пациентов с ГЛПС был проведен анализ их 95 %‑х доверительных интервалов и выполнено построение ROC-кривых (рис. 3).

Как следует из рисунка 3, уровни всех трех информативных цитокинов показали довольно высокую прогностическую значимость. Так, в пользу ГЛПС на самых начальных этапах заболевания свидетельствовали уровень ИЛ‑6 в сыворотке крови выше 24 пг/мл (AUC = 0,903), уровень ФНОβ выше 55 пг/мл (AUC = 0,818), уровень ИЛ‑10 выше 11,3 пг/мл (AUC = 0,982).

Рис. 3. 95 % доверительные интервалы уровней ИЛ‑6, ФНОβ, ИЛ‑19 (пг/мл) в сыворотке крови в группах исследования и ROC-кривые их прогностического значения
Fig. 3. 95 % confidence intervals of IL‑6, TNFβ, IL‑10 levels (pg/ml) in the serums of study group patients and ROC curves of their prognostic value

Далее определялись корреляционные связи между информативными показателями, относящимися к фенотипическим характеристикам лимфоцитов и цитокинового профиля в крови, на ранних этапах ГЛПС и ОРВИ с использованием коэффициента корреляции Спирмена (рис. 4).

Рис. 4. Достоверные корреляции между информативными иммунологическими признаками при ГЛПС на ранних этапах заболевания и в группе сравнения (ОРВИ)
Fig. 4. Significant correlations between informative immunological signs in the early stages of HFRS and in the comparison group (ARVI)

Как следует из рисунка, показатели, проявившие информативность при ГЛПС, формировали целый ряд статистически значимых корреляций при данном заболевании, чего практически не наблюдалось в группе сравнения — при острых респираторных вирусных инфекциях.

При ГЛПС основным участником почти всех выявленных корреляционных пар служили NKG2D+ цитотоксические Т-лимфоциты, которые были связаны со всеми другими информативными фенотипами, а также с противовоспалительным цитокином ИЛ‑10: с В-лимфоцитами и ИЛ‑10 отрицательной корреляцией, а с регуляторными клетками CD4+ и CD8+ положительной корреляцией. Кроме того, ИЛ‑10 отрицательно коррелировал с числом CD4+ регуляторных Т-клеток. Ничего подобного не отмечалось при ОРВИ, при этой группе вирусных инфекций регистрировалась только одна положительная корреляция — между CD4+ и CD8+ регуляторными Т-клетками, что довольно естественно.

По результатам, полученным в процессе данного исследования, специального обсуждения заслуживает вопрос о том, насколько патогномоничными и патогенетически оправданными для ГЛПС являются прежде всего установленные на ранних стадиях инфекционного процесса сдвиги со стороны таких фенотипов лимфоцитов как рост числа В-лимфоцитов, NKG2D+ ЦТЛ, СD4+ и CD8+ регуляторных Т-клеток.

Проблема сравнительной оценки полученных нами данных с результатами исследований ГЛПС другими авторами осложняется ограниченным распространением этого заболевания только в эндемичных природных очагах, а также, как правило, отсутствием дифференцированного подхода к характеристике иммунопатогенеза ГЛПС в зависимости от стадии инфекционного процесса. В связи с этим следует отметить выраженную ограниченность публикаций, посвященных особенностям иммунопатогенеза на начальных этапах ГЛПС.

Так, в общей характеристике иммунопатогенеза ГЛПС подчеркивается, что данная инфекция сопровождается довольно ранней выработкой антител В-лимфоцитами (начиная с 3–5‑го дня заболевания), что отмечено и в наших исследованиях, и приводит к чрезмерной иммунной реактивности, включая массивные цитокиновые реакции и активацию цитотоксических лимфоцитов [14]. На начальных этапах заболевания отмечается роль в диссеминации возбудителя из места проникновения через слизистую оболочку бронхов с активным участием моноцитов и плазмацитоидных дендритных клеток (пДК) c их способностью к индукции гуморального иммунного ответа [15]. Известно, что во время острых инфекций пДК обычно продуцируют высокие уровни интерферонов I типа. Однако поражение этих клеток ортохантавирусами нарушает их функции, что способствует распространению возбудителей во время острой фазы ГЛПС, а также развитию иммунных реакций по клеточному типу, в первую очередь, с участием CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов [15, 16]. Особенно подчеркивается, что наиболее сильный ответ со стороны CD8+ Т-клеток наблюдается во время острой фазы [17], однако при всем обилии сведений о ведущей роли этих клеток в ответ на ортохантавирусную инфекцию в доступной литературе мы не обнаружили сведений о роли NKG2D-зависимого механизма активации ЦТЛ при ГЛПС и его патогенетическом значении, которое мы в своих работах трактуем с позиций раннего формирования иммунологической памяти, обеспечивающего исключительно острое течение данного инфекционного процесса [12].

Отмечен рост числа регуляторных Т-клеток (Трег, FoxP3⁺) с их иммуносупрессорной активностью при ГЛПС [18]. Это явление имеет неоднозначное трактование. Существует такое объяснение, что причина высоких значений Трег кроется в обследовании лиц из эндемичных регионов, ранее уже сталкивавшихся с ортохантавирусами [19]. Некоторые авторы придают этой особенности иммунного реагирования на ортохантавирусы как фактору, снижающему воспалительно-­деструктивные процессы при ГЛПС [5], в то же время есть точка зрения, что именно рост числа FoxP3⁺ Т-лимфоцитов (Трег) определяет тяжесть течения ортохантавирусной инфекции, при этом отмечен рост как СD4+, так и СD8+ Трег [20]. Есть сведения о том, что Трег выполняют особую функцию в защитных реакциях на повреждение, восстановление и поддержание тканей [21]. В то же время мы не встретили сведений о том, что нарастание числа этих клеток наблюдается при ГЛПС уже в первые дни инфекционного процесса, а также указаний на возможную положительную корреляционную связь этих клеток с NKG2D+ ЦТЛ.

Что касается сопутствующих системных воспалительных реакций, то, как отмечено и в наших исследованиях, рост ИЛ‑6 и ФНО в крови, а также в моче еще в лихорадочный период широко обсуждается в литературе, при этом ассоциируется как с размножением ортохантавирусов в эндотелии сосудов, так и с нарушением функции почек [22]. Отмечается также зарегистрированное и нами значительное повышение в крови уровня ИЛ‑10 на ранних стадиях заболевания, патогенетическое значение которого оценивается с позиций его прогностического значения при тяжелом течении ГЛПС [22].

Выводы

1. Развитие геморрагической лихорадки с почечным синдромом уже на самых ранних этапах заболевания сопровождается особым набором иммунологических сдвигов, касающихся корреляционно связанных между собой фенотипических характеристик лимфоцитов и особенностей цитокинового профиля крови.
2. По выраженности наблюдаемых иммунологических изменений ГЛПС статистически достоверно отличается от других вирусных инфекций (ОРВИ) с примерно схожим механизмом заражения.
3. В диагностически значимые критерии ранней диагностики ГЛПС входит рост содержания в крови цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), экспрессирующих активирующий лектиновый рецептор NKG2D (>25 %), регуляторных CD4⁺ (>7,8 %) и CD8⁺ (>9,5 %) Т-клеток, В-лимфоцитов (>12,6 %), интерлейкина-10 (>11,3 пг/мл), а также интерлейкина-6 (>24 пг/мл) и фактора некроза опухолей β (>55 пг/мл).
4. Ключевое патогенетическое значение роста CD3+CD8+CD314+ ЦТЛ при ГЛПС создает перспективу раскрытия новых мишеней для иммунотерапии ГЛПС и разработки новых принципов получения вакцинных препаратов с целью профилактики этого заболевания.

Об авторах

М. Ф. Иванов

Самарский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: m.f.ivanov@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2528-0091
SPIN-код: 2195-3768
г. Самара, Российская Федерация

И. П. Балмасова

Российский университет медицины

Email: m.f.ivanov@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8194-2419
SPIN-код: 8025-8611
г. Москва, Российская Федерация

Е. С. Малова

Медицинский университет «Реавиз»

Email: m.f.ivanov@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-5710-3076
SPIN-код: 8207-7835
г. Самара, Российская Федерация

Д. Ю. Константинов

Самарский государственный медицинский университет

Email: m.f.ivanov@samsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-6177-8487
SPIN-код: 3061-8265
г. Самара, Российская Федерация

Список литературы

Дополнительные файлы