Expression of immune-associated genes in isolated classical monocytes in preeclampsia

Full Text

Введение

Преэклампсия (ПЭ) — это серьезное осложнение беременности, характеризующееся повышенным кровяным давлением в сочетании с протеинурией или проявлениями полиорганной недостаточности после 20 недели беременности [1]. ПЭ может привести к прогрессирующим нарушениям со стороны органов матери (например, печени, почек) и угрозе для здоровья плода. Симптомы ПЭ могут включать головные боли, отеки, зрительные нарушения и боль в верхней части живота [2]. Лечение данной опасной гестационной патологии обычно включает медикаментозный контроль артериального давления и экстренное родоразрешение при развитии тяжелых форм ПЭ. Несмотря на большой массив исследований, посвященных ПЭ, ее точные причины до сих пор не установлены [3], что связано в том числе со сложностью получения биоматериала для исследований.

Иммунологический аспект развития ПЭ представляет наибольший интерес для исследователей и в большей степени изучается со стороны матери [4]. И если роль NK-клеток, Treg и резидентных макрофагов в патогенезе ПЭ наиболее изученная область [5–7], то участие моноцитов в развитии ПЭ активно исследуется. Развитие нормальной беременности опосредовано тонким балансом прокоагулянтных, воспалительных реакций и ангиогенеза, о чем свидетельствуют результаты single-cell РНК секвенирования мононуклеарной фракции крови пациентов с ПЭ и физиологической беременностью и in vitro изучение взаимодействия моноцитов и тромбоцитов посредством тканевого фактора CD142 и маркера активации тромбоцитов CD61 [4, 8]. В ряде работ показано, что при ПЭ в крови повышается доля неклассических моноцитов (CD16+) [9, 10], участвующих в фагоцитозе клеточного дебриса в кровяном русле и являющихся основным источников провоспалительного цитокина TNFa. Однако в недавнем исследовании [11] анализ результатов single-cell РНК секвенирования плацент ПЭ с ранней и поздней манифестацией было выявлено, что доля неклассических моноцитов была снижена при поздней ПЭ. При этом также наблюдается снижение уровня классических моноцитов (CD14+) [12], составляющих в норме до 90 % всей моноцитарной популяции и служащих основным источником макрофагов в ткани, куда они попадают после экстравазации из сосудистого русла.

Прицельное изучение транскрипционного профиля моноцитов периферической крови матери встречается в единичных работах, чего нельзя сказать о цельной крови или мононуклеарной фракции. На основе результатов microarray клеток периферической крови женщин с ранней и поздней ПЭ авторы [13] предположили, что определение уровней экспрессии генов длинной некодирующей белок РНК — H19, фибронектина 1 (FN1), тубулина бета‑6 класса V (TUBB6) и формилпептидного рецептора 3 (FPR3) можно использовать для прогнозирования ранней ПЭ на 22–28 неделе беременности. А определение уровней экспрессии генов MMP11, SLC6A2 и IL18BP позволяет предсказать раннюю ПЭ на 11–17 неделе беременности. При анализе на уровне единичных клеток мононуклеарной фракции крови были выделены следующие подмножества моноцитов: моноциты экспрессирующие белки версикан и фиколин 1 (VCAN+ моноциты или VCAN+FCN1+), классические моноциты (CD14+FCN1+), IFN- неклассические моноциты (CD16+FCN1+IFNTM3-) и IFN+ неклассические моноциты (CD16+IFITM3+FCN1+) [4]. В данной работе было отмечено, что в крови пациенток с ПЭ увеличивается количество классических моноцитов и уменьшается количество IFN-неклассических моноцитов, что диаметрально противоположно ранее полученным результатам [12]. Это говорит о том, что результаты секвенирования на уровне единичных клеток дают огромный массив информации, нуждающейся в дополнительном подтверждении на уровне экспериментов in vitro.

Ранее нами был проведен анализ изолированных моноцитарных популяций, который выявил, что в классических моноцитах активируются сигнальные пути, связанные с воспалением, апоптозом, интерлейкиновым сигналингом и др. [14]. Среди подавленных сигнальных путей была активация Т клеток, EGF и PDGF сигналлинг. Нами были выбраны гены CXCR1, CXCL8, JUN, ADGRE4P, IL7R и ARL17A как те, что показали наибольшие различия. В контексте ПЭ гены CXCR1 и CXCL8 критичны для процесса ремоделирования спиральных артерий матки [15], а их активация вовлечена в нарушение инвазии трофобласта путем привлечения нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов и тромбоцитов [16]. Транскрипционных фактора JUN участвует в регуляции дифференцировки трофобласта [17]. В классических моноцитах при ПЭ эти и остальные выбранные нами гены ранее не изучались. Цель: оценить экспрессию генов CXCR1, JUN, CXCL8, ADGRE4P, IL7R, ARL17A, вовлеченных в клеточную адгезию и воспалительный ответ, в изолированных классических моноцитах у женщин с физиологической беременностью и пациенток с ПЭ.

Материалы и методы

Этическое разрешение

Все эксперименты с участием пациентов проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией и были одобрены Комиссией по биомедицинской этике при НМИЦ Акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Минздрава России, г. Москва (протокол № 5 от 27 мая 2021 г.). У всех пациенток было получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании и обработку персональных данных согласно Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации и в соответствии с требованиями Этического комитета.

Сбор образцов

Исследование проводилось в НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации. В контрольную группу (n = 9) вошли пациентки, имеющие рубец на матке после предыдущего кесарева сечения, миопию высокой степени, миомоэктомию в анамнезе, пациентки с диспластическим сколиозом, пациентки с поперечным положения плода. Для группы ПЭ (n = 8) кесарево сечение было связано с нарастанием тяжести ПЭ, ухудшением состояния плода (нарушения кровотока в артериях пуповины или венозном кровотоке). Критерием исключения в обоих группах являлись женщины с отягощенным внеакушерским анамнезом. Классические моноциты выделяли из 15 мл цельной крови. Периферическую кровь собирали путем пункции локтевой вены перед операцией кесарево сечение в пробирки, обработанные ЭДТА (BD Vacutainer Plus).

Выделение мононуклеаров периферической крови и классических моноцитов

Периферическую кровь разбавляли промывочным раствором autoMACS (Miltenyi biotec, Германия) в соотношении 1:1. В новую стерильную пробирку добавляли 5 мл градиентной среды Lympholyte-­H (Cedarlane, Канада) и наслаивали равный объем разведенной крови. Затем пробирку центрифугировали в течение 15 минут при 400  g,+18 °C, без торможения. С помощью дозатора фракцию мононуклеарных клеток, образовавшеюся на границе между плазмой и Lympholyte-­H, собирали в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавляли 10 мл промывочного раствора autoMACS, полученную смесь ресуспендировали и центрифугировали при 300 g в течение 15 минут, +11 °C, образовавшийся супернатант удаляли. Клеточный осадок ресуспендировали и проводили выделение CD14+ моноцитов с помощью магнитной сепарации частицами с конъюгированными антителами к рецептору CD14 (130-050-201, MicroBeads, human, Miltenyi Biotec, Германия) согласно протоколу производителя.

ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК из выделенных классических моноцитов выделяли реагентом QiaZOL Lysis Reagent (Qiagen, США) согласно протоколу производителя. Обратная транскрипция проводилась с использованием 0,5 мкг РНК набором MMLV-RT («Евроген», Россия) при 40 °C в течение 40 мин. Смеси для ПЦР в реальном времени готовили в реакционном объеме 20 мкл, содержащем 150 нг кДНК, 0,3 мкМ праймеров и 4 мкл 5xSybrGreen-mix («Евроген», Россия) в трех технических повторах. Последовательности праймеров приведены в Таблице 1. ПЦР в реальном времени проводили в термоциклере ДТ‑96 (ООО «ДНК-Технологии», Россия). Уровни экспрессии генов рассчитывали относительно референсного гена глицеральдегид‑3‑фосфатдегидрогеназы (GAPDH) в программе QGENE.

Таблица 1/ Table 1
Последовательности праймеров / Primer sequences

Название праймера / Primer name	Последовательность / Sequence Forward	Последовательность / Sequence Reverse
CXCR1	ATCTTCCTGCTTTGCTGGCT	GGTAACACGATGACGTGCCA
JUN	AGTCCTTGTTCCACTGTGCC	GGACTCTGCCACTTGTCTCC
CXCL8	AGTCCTTGTTCCACTGTGCC	CACAGCACTACCAACACAGC
ADGRE4P	GCTCTCATGTGCACAGCAAC	AGGTGCTGGTGTTCTGGATG
IL7R	ACGATGTAGCTTACCGCCAG	TAGGATCCATCTCCCCTGAGC
ARL17A	GTCGGCGGTGTTGTAGGTAG	TGTCTCCACACAGAAACCTACTG
GAPDH	GCACCGTCAAGGCTGAGAAC	TGGTGAAGACGCCAGTGGA

Проточная цитометрия

Классические моноциты, полученные из периферической крови от пациенток исследуемой и контрольной группы, окрашивали антителами к CD14 (Клон: REA599, Miltenyi Biotec, Германия) и CD16 (3G8, Beckman Coulter, США) для оценки чистоты выделенной популяции. Моноклональные антитела к CD14 человеку инкубировали с суспензией 1×10⁵ клеток в 100 мкл autoMACS® Rinsing Solution (Miltenyi Biotec, Германия) с 0,1 % MACS® BSA Stock Solution (Miltenyi Biotec, Германия), при 4 °C в течение 10 мин в темноте. Клетки центрифугировали 500 g x 5 мин и ресуспендировали в PBS (натрий-­фосфатный буфер) перед проведением анализа. Все образцы анализировались на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). В каждом измерении проводился набор не менее 10000 клеток. Данные проточной цитометрии были либо проанализированы в программе BD CellQuest (Becton Dickinson, США), либо экспортированы и проанализированы в программном обеспечении FlowJo™ v10 (FlowJo LLC, США).

Статистический анализ

Статистический анализ был проведен в программе Prism 7.0 (GraphPad, США) с использованием теста Шапиро–­Вилка для оценки нормальности распределения, критериями Манна-–Уитни и t-test для попарного сравнения. Различия считались статистически достоверным при уровне значимости p<0.05.

Результаты и обсуждение

В ходе исследования были получены образцы от 17 пациенток, которые на основании поставленного диагноза были распределены на две группы: контрольная (далее контроль) — пациентки с неотягощенным внеакушерским анамнезом и физиологическим течением беременности (n = 9) и пациентки с поздней ПЭ (n = 8), развившейся после 34 недели беременности (Табл. 2).

Таблица 2
Демографические и клинические характеристики пациенток

Характеристики	Контроль	ПЭ
Количество	9	8
Возраст матери, лет	31,7 ± 3,4	31,4 ± 3,7
Срок гестации на момент родоразрешения	38,6 ± 0,8	37,1 ± 0,7
Систолическое артериальное давление, мм рт. ст.	115,4 ± 7,2	140,4 ± 8,3*
Диастолическое артериальное давление, мм рт. ст.	72,9 ± 5,0	91,0 ± 9,4*
Протеинурия, г/л	0,0	1,9 ± 2,6*
Масса новорожденного, г	3455,0 ± 488,8	2513,6 ± 362,9*
Пол новорожденного (муж./жен.)	4/5	2/6
Задержка внутриутробного развития, количество случаев	0	3
Беременность по счету 1≥ 2, %	36	44
Анестезия	Эпидуральная	Эпидуральная/наркоз

Примечание: Данные представлены как среднее ± SD, *p < 0,01

Table 2
Patents’ demographic and clinical characteristics

Characteristics	Control	РE
Number	9	8
Maternal age, years	31,7 ± 3,4	31,4 ± 3,7
Gestational age at delivery, weeks	38,6 ± 0,8	37,1  ±  0,7
Systolic blood pressure, mm Hg	115,4 ± 7,2	140,4 ± 8,3*
Diastolic blood pressure, mm Hg	72,9 ± 5,0	91,0 ± 9,4*
Proteinuria, g/L	0,0	1,9 ± 2,6*
Newborn mass, g	3455,0 ± 488,8	2513,6 ± 362,9*
Newborn gender (Male/Female)	4/5	2/6
Intrauterine growth restriction, number of cases	0	3
Gravida 1≥ 2, %	36	44
Anesthesia	Epidural	Epidural/narcosis

Note: Data are presented as mean±SD, *p < 0.01.

Значения систолического и диастолического артериального давления, а также показатель протеинурии были достоверно выше в группах у пациенток с ПЭ, чем в контрольной группе. Также наблюдались достоверные различия по массе плода при рождении между группами ПЭ и контроля.

От всех пациенток, включенных в исследование, были получены образцы периферической крови, из которой выделяли классические CD14+ моноциты. Полученные фракции моноцитов окрашивались антителами против CD14 для проверки чистоты сортинга, которая составила более 80 % во всех полученных пробах. Минорный процент популяции окрашивался антителами к CD16, что может указывать на незначительную примесь клеток, экспрессирующих оба типа рецепторов. Такую субпопуляцию моноцитов относят к промежуточным. Репрезентативное окрашивание приведено на Рисунке 1.

Рис. 1. Репрезентативные дот-плот диаграммы бокового и фронтального светорассеяния пробы контрольной группа (А) и группы ПЭ (Б). Репрезентативные гистограммы окрашивания анти-­CD14 (В, Г) и анти-­CD16 антителами (Д, Е) (зеленая заливка) пробы контрольной группа (В, Д) и группы ПЭ (Г, Е). Неокрашенный контроль — синяя заливка. Процент положительных клеток указан над маркером

Fig.1. Representative dot plots of side and frontal scatter of the control group (A) and PE group (B) samples. Representative histograms of anti-CD14 (C, D) and anti-CD16 (E, F) staining (green shading) of the control group (C, E) and PE group (D, F) samples. Unstained control – blue. The percentage of positive cells is indicated above the marker

В полученных классических CD14+ моноцитах исследовали уровни экспрессии генов CXCR1, JUN, CXCL8, ADGRE4P, IL7R, ARL17A методом ПЦР в реальном времени. Таблица, суммирующая функции каждого из генов, представлена ниже (табл. 3).

 Таблица 3
Названия генов цитокинов, рецепторов и белков, их функции и роль в организме

Название гена	Функции	Роль в норме и при патологии	Источник
CXCR1(CD128; CD181; CKR‑1; IL8R1 etc.)	Ген высокоаффинного рецеп­тора IL‑8. Экспрессируется в различных тканях, включая костный мозг, сетчатку глаза, сердце, легкие и плаценту.	Изменения экспрессии CXCR1 во время беременности может влиять на иммунную функцию и восприимчивость к инфекциям. Показано, что доля моноцитов, экспрессирующих CXCR1, уве-личивается во время беремен­ности в ответ на активацию TLR3 пути. Снижение экспрессии CXCR1 в эндотелиальных клетках пуповины ассоции-­рована с гибелью плода.	[18–20]
JUN(AP1; p39; AP‑1; cJUN; c-­Jun etc.)	Ген транскрипционного фак­тора, который регули­рует экспрессию генов, участвующих в пролиферации, дифференцировке, выживании и воспалении клеток.	В клетках, лишенных Jun, повышается экспрессия p53 и p21, наблюдаются дефекты клеточного цикла. Экспрессия гена Jun помогает поддерживать иммунный гомеостаз. C-Jun участвует в активации макрофагов, регулируя экспрессию про- и противовоспалительных генов при стимуляции различными цитокинами, про- или противовоспалительными стимулами, а также микробными агентами. Максимальная экспрессия JUN наблюдается на ранних сроках беременности.	[21–23]
CXCL8(IL‑8; NAF; GCP1 etc.)	Ген кодирует хемокин интер­лейкин‑8 (IL‑8), который является одним из основных медиаторов воспалительной реакции.	IL‑8 секретируется мононуклеарными макрофагами, нейтрофилами, эозинофилами, Т-лимфоцитами, эпителиаль-ными клетками и фибробластами. IL‑8 играет роль в регулировании привлечения и активации нейтрофилов, что может быть важно для развития плода и защиты от воспаления. IL‑8 играет гомеостатическую роль, в частности регулирует выход нейтрофилов из костного мозга и индукцию миграции нейтрофилов. При материнской аллоиммунизации (воспали-­тельной реакции против белковых антигенов в эритроцитах плода) уровень IL‑8 значительно повышается.	[24, 25]
ADGRE4P (EMR4; FIRE; EMR4P; PGR16; GPR127)	Псевдоген рецептора GPCR, отвечающего за адгезию и миграцию лейкоцитов.	Экспрессируется в различных тканях человека, связанных с иммунитетом, включая тимус, селезенку, моноциты и дендритные клетки. Несмотря на то, что он является псевдогеном, существует предположение, что секретируемый белок из 232 аминокислот, образующийся в результате сдвига рамки считывания, может иметь биологическую функцию.	[26]
IL7R (ILRA; CD127; IL7RA etc.)	Ген кодирует рецептор для IL‑7.	IL‑7 — важнейший цитокин, регулирующий пролиферацию Th‑17 клеток. Сообщается, что Th‑17 клетки негативно влияют на имплантацию эмбриона. Повышенная экспрессия IL7 в децидуальных клетках при выкидышах указывает на его роль в сигнализации клеток плаценты. Чрезмерная экспрессия IL‑7 может приводить к ранним потерям беременности.	[27, 28]
ARL17A (ARF1P2; ARL17P1)	Белок, кодируемый геном ARL17A, обладает способностью связывать ГТФ и участвует во внутриклеточном транспорте белков.	Участвует во многих регуляторных путях, имеющих отношение к канцерогенезу человека.	[29]

Table 3
Genes of cytokines, receptors and proteins, their functions and role in the organism

Gene	Function	Role	Ref.
CXCR1(CD128; CD181; CKR‑1; IL8R1, etc.)	High-affinity IL‑8 receptor gene. Expressed in various tissues including bone marrow, retina, heart, lungs, and placenta.	Alterations in CXCR1 expression during pregnancy may affect immune function and susceptibility to infections. The proportion of monocytes expressing CXCR1 has been shown to increase during pregnancy in response to TLR3 pathway activation. Decreased CXCR1 expression in umbilical cord endothelial cells is associated with fetal death.	[18–20]
JUN(AP1; p39; AP‑1; cJUN; c-­Jun, etc.)	A transcription factor gene that regulates the expression of genes involved in cell proliferation, differentiation, survival, and inflammation.	In cells lacking Jun, p53 and p21 expression increases, and cell cycle defects are observed. Jun gene expression helps maintain immune homeostasis. c-­Jun is involved in macrophage activation by regulating the expression of pro- and anti-inflammatory genes upon stimulation by various cytokines, pro- or anti-inflammatory stimuli, and microbial agents. Maximum JUN expression is observed in early pregnancy.	[21–23]
CXCL8(IL‑8; NAF; GCP1, etc.)	The gene encodes the chemokine IL‑8, which is one of the main mediators of the inflammatory response.	IL‑8 is secreted by mononuclear macrophages, neutrophils, eosinophils, T-lymphocytes, epithelial cells, and fibroblasts. IL‑8 plays a role in regulating the recruitment and activation of neutrophils, which may be important for fetal development and protection against inflammation. IL‑8 plays a homeostatic role, in particular, it regulates the release of neutrophils from the bone marrow and the induction of neutrophil migration. In maternal alloimmunization (an inflammatory reaction against protein antigens in fetal red blood cells), the level of IL‑8 increases significantly.	[24, 25]
ADGRE4P (EMR4; FIRE; EMR4P; PGR16; GPR127)	A pseudogene of a GPCR receptor involved in leukocyte adhesion and migration.	It is expressed in a variety of human immune-­related tissues, including the thymus, spleen, monocytes, and dendritic cells. Although a pseudogene, it has been suggested that the 232‑amino acid secreted protein resulting from the frameshift may have a biological function.	[26]
IL7R (ILRA; CD127; IL7RA, etc.)	The gene encodes a receptor for IL‑7.	IL‑7 is a key cytokine that regulates the proliferation of Th‑17 cells. Th‑17 cells have been reported to negatively affect embryo implantation. Increased IL7 expression in decidual cells in miscarriages indicates its role in placental cell signaling. Excessive IL‑7 expression may lead to early pregnancy loss.	[27, 28]
ARL17A (ARF1P2; ARL17P1)	The protein encoded by the ARL17A gene has the ability to bind GTP and is involved in intracellular protein transport.	It is involved in many regulatory pathways related to human carcinogenesis.	[29]

Экспрессия иммунно-­ассоциированного гена IL7R не выявила различий между группами. IL7R кодирует рецептор для интерлейкина‑7 (IL‑7), который критически важен для развития и выживания T-лимфоцитов и B-лимфоцитов. Он играет ключевую роль в иммунной системе, обеспечивая поддержание и развитие клеток, отвечающих за адаптивный иммунитет [27].

Рис. 2. Уровень относительной экспрессии генов IL7R и JUN в классических CD14+ моноцитах от пациенток с физиологической беременностью (контроль) и пациенток с ПЭ

Fig. 2. Relative expression level of IL7R and JUN genes in classical CD14+ monocytes from patients with physiological pregnancy (control) and patients with PE

При анализе уровня относительной экспрессии гена JUN было показано, что он схож между группой контроля и ПЭ (рис. 2). Ген JUN кодирует один из компонентов транскрипционного фактора AP‑1 (Activator Protein 1), который регулирует экспрессию генов, участвующих в клеточном росте, дифференцировке и апоптозе [21, 22]. JUN играет важную роль в реакциях на стресс и воспалительные процессы.

При исследовании гена CXCR1 также не было получено значимых различий его экспрессии между группами (рис. 3). CXCR1 — это рецептор хемокина CXCL8 (IL‑8). Он играет ключевую роль в иммунном ответе, регулируя миграцию нейтрофилов и других клеток иммунной системы к местам инфекции и воспаления [18, 20].

В случае гена CXCL8 мы наблюдали значимое снижение его экспрессии в классических моноцитах от пациенток с ПЭ по сравнению с моноцитами от пациенток контрольной группы (рис. 3). CXCL8, также известный как интерлейкин‑8 (IL‑8), является хемокином-­лигандом исследованного нами выше гена рецептора CXCR1 [24, 25].

Рис. 3. Уровень относительной экспрессии генов JUN и CXCL8 в классических CD14+ моноцитах от пациенток с физиологической беременностью (контроль) и пациенток с ПЭ. *p<0,05

Fig. 3. Relative expression level of JUN and CXCL8 genes in classical CD14+ monocytes from patients with physiological pregnancy (control) and patients with PE. *p<0.05

Также нами было выявлено значимое повышение экспрессии гена ADGRE4P в группе с ПЭ (рис. 4). ADGRE4P — это псевдоген, который, как предполагается, является неактивной версией гена ADGRE4. ADGRE4P является членом семейства генов рецептора EGF-TM7, который, как полагают, играет роль в адгезии и миграции лейкоцитов [26].

Несмотря на некоторое снижение уровня относительной экспрессии ARL17A в той же группе, статистическая значимость не была достигнута. ARL17A относится к семейству малых GTPаз и предполагается, что он участвует в регуляции клеточной активности, включая взаимосвязь с клеточным цитоскелетом, изменениями в клеточной мембране и транспортом внутри клетки [29].

Рис. 4. Уровень относительной экспрессии генов ADGRE4P и ARL17A в классических CD14+ моноцитах от пациенток с физиологической беременностью (контроль) и пациенток с ПЭ. *p<0,05

Fig. 4. Relative expression level of ADGRE4P and ARL17A genes in classical CD14+ monocytes from patients with physiological pregnancy (control) and patients with PE. *p < 0.05

Среди моноцитов периферической крови человека принято выделять три субпопуляции: классическую (CD14++CD16+), неклассическую (CD14-CD16++) и промежуточную (CD14+CD16++) на основании экспрессии на поверхности моноцитов паттерн- распознающего рецептора CD14 и Fc гамма III рецептора CD16 [30]. ПЭ, как тяжелое гестационное осложнение, опосредованное в том числе нарушениями иммунного взаимодействия мать-плод, представляет большой интерес в том числе с точки зрения участия моноцитов в этой патологии. Развитие технологий, в частности секвенирования, постепенно меняет наше понимание многообразия субпопуляций моноцитов и их роли при ПЭ. Четыре альтернативные субпопуляции моноцитов, циркулирующих в периферической крови, были выявлены при анализе на уровне единичной клетки в мононуклеарной фракции крови Zhou и коллегами [4].

Изменение субпопуляций моноцитов периферической крови при ранней и поздней ПЭ стало объектом исследования в работе Bernier [31]. Авторы показали, что уровень классических моноцитов был высоким как при ранней, так и при поздней ПЭ, то время как неклассические моноциты были снижены только в группе ранней ПЭ [31]. Также было доказано снижение количества регуляторных Т-клеток в обеих группах по сравнению с контрольной и уменьшение количества Th2 лимфоцитов при поздней ПЭ. Интересно, что повышение уровня цитокинов/хемокинов и факторов роста отмечались в случае поздней ПЭ в отличие от контрольной группы и ранней ПЭ. Также при поздней ПЭ авторы отмечали увеличение уровня моноцитов, продуцирующих IL‑12, TNF-a и IL‑1b, по сравнению с группой контроля.

Предпосылками к данному исследованию послужили раннее полученные нами данные microarray анализа выделенных из крови пациенток с ПЭ классических и неклассических моноцитов [14]. Нами были выбраны ключевые гены, задействованные в выявленных сигнальных путях и проведена оценка их экспрессии. Среди наиболее интересных результатов можно отметить изменения в экспрессии CXCL8, что согласуется с ранее опубликованными нами данными микрочипового анализа. При ПЭ происходило снижение относительного уровня экспрессии CXCL8. В работе Pinheiro и коллег анализ цитокинов в плазме крови показал, что уровень CXCL8 был значительно выше у женщин с ПЭ по сравнению с небеременными женщинами [32]. В другом исследовании также были обнаружены более высокие концентрации CXCL8 в сыворотке у пациенток с ПЭ, что подчеркивает роль CXCL8 в ее патогенезе [33]. Вероятно, наблюдаемые нами результаты являются компенсаторным эффектом, призванным снизить продукцию CXCL8 моноцитами при ПЭ.

В ходе многоэтапного биоинформатического анализа ген IL7R был идентифицирован как один из hub-генов, который может быть использован в качестве диагностического биомаркера ПЭ [34]. Для проверки этого результата был проведен метод ПЦР в реальном времени, результаты которого показали повышенный уровень экспрессии гена IL7R в тканях плаценты пациенток с ПЭ в сравнении с контролем. В нашем исследовании, однако, экспрессия IL7R, равно как и JUN и ARL17A в классических моноцитах, не изменялась.

Интересное находкой явилось значимое повышение экспрессии псевдогена adhesion G protein-­coupled receptor E4 (ADGRE4P) при ПЭ. ADGRE4P — представитель класса Б (адгезионный, Adhesion GPCRs) суперсемейства рецепторов, сопряженных с G-белком, распознающих различные лиганды (гормоны, нейротрансмиттеры), и таким образом опосредующие регуляцию ключевых физиологических процессов. Роль отдельных представителей семейства Adhesion GPCRs показана при патологиях беременности, таких как невынашивание [35] и гипоксия плода [36]. Особенностью рецепторов подсемейства Е является наличие Epidermal Growth Factor-like домена. Наиболее описанным представителем является ADGRE5/CD97. Для CD97 показано участие в процессе инвазии трофобласта через PI3K/Akt/mTOR сигнальный путь, а его низкий уровень экспрессии в плаценте ассоциирован с ПЭ [37]. Функции рецептора ADGRE4 и его псевдогена слабо описаны. Предполагают, что ADGRE4Р может опосредовать клеточное взаимодействие между миелоидными клетками и В-клетками [38]. При анализе данных транскриптома лейкоцитов крови и моноцитов женщин со спонтанными преждевременными родами было выявлено значимое снижение уровня экспрессии гена ADGRE4P как в моноцитах, так и в лейкоцитах [39]. Также значимо низкий уровень экспрессии этого гена был выявлен при RNA-seq плацент при нормальной беременности и внутриутробной задержке развития плода [40].

Полученные в данной работе результаты являются дополнением к уже имеющимся данным других исследователей ввиду того, что описывают изменения, происходящие на уровне экспрессии генов в изолированной субпопуляции классических моноцитов, а не цельной крови или ее мононуклеарной фракции, как в упомянутых работах коллег [4, 31].

Ограничения исследования

Ограничением данного исследования является малый размер выборок, обусловленный сложностью взятия биоматериала.

Выводы

В заключение стоит отметить, что несмотря на малый размер выборок, результаты проделанной работы вносят весомый вклад в понимание роли отдельных субпопуляций моноцитов в развитие ПЭ. Очевидно, что моноциты могут изменять цитокиновый профиль плазмы крови пациенток с ПЭ, усиливать реакции врожденного иммунитета, в том числе воспаление. Будучи костномозговыми предшественниками в том числе плацентарных макрофагов, моноциты вовлечены в течение нормальной беременности, начиная с успешной имплантации эмбриона. Полученные нами данные указывают на то, что экспрессия CXCL8 (IL‑8) претерпевает серьезные изменения в классических моноцитах при ПЭ.

About the authors

Polina A. Vishnyakova

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: vishnyakova-pa@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0001-8650-8240
SPIN-code: 3406-3866
Moscow, Russian Federation

Viktoriia V. Kiseleva

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: vishnyakova-pa@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-3001-4820
SPIN-code: 2698-1448
Moscow, Russian Federation

Anastasiya S. Poltavets

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: vishnyakova-pa@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-1619-3500
SPIN-code: 6782-1376
Moscow, Russian Federation

V. E. Karyagina

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: vishnyakova-pa@rudn.ru
ORCID iD: 0009-0001-3484-9577
Moscow, Russian Federation

Aida A. Bagdasarian

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: vishnyakova-pa@rudn.ru
Moscow, Russian Federation

Evgeny N. Knyazev

National Research University Higher School of Economics;
M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry

Author for correspondence.
Email: vishnyakova-pa@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-9414-2573
SPIN-code: 4972-5652
Moscow, Russian Federation

Kamilla T. Muminova

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: vishnyakova-pa@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0003-2708-4366
SPIN-code: 2893-9966
Moscow, Russian Federation

Zulfiya S. Khodzhaeva

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: vishnyakova-pa@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0001-8159-3714
SPIN-code: 9714-5970
Moscow, Russian Federation

Andrey V. Elchaninov

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology; Research Institute of Human Morphology named after Academician A.P. Avtsyn, Russian Scientific Center of Surgery named after Academician B.V. Petrovsky

Email: vishnyakova-pa@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-2392-4439
SPIN-code: 5160-9029
Moscow, Russian Federation

Gennady T. Sukhikh

V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: vishnyakova-pa@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0002-7712-1260
SPIN-code: 9374-5710
Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files