Сравнительный анализ избирательности флуоресцентных методов для экологического мониторинга экотоксикантов

Полный текст

Введение Экотоксиканты - полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) включены Стокгольмской конвенцией (2001 г.) в ряд стойких органических загрязнителей. Поскольку ПАУ обладают сильной канцерогенной, мутагенной и тератогенной активностью [1], они наносят большой ущерб здоровью человека и животных даже при «следовых» концентрациях в окружающей среде. Для эффективного контроля ПАУ крайне важным является выбор подходящих методов их обнаружения. Широко распространены хроматографические методы анализа ПАУ. Однако они обладают рядом недостатков: необходимостью дорогостоящего аппаратурного оснащения, длительностью и сложностью пробоподготовки и анализа. В связи с этим для обеспечения растущих потребностей экоаналитического контроля актуальными являются разработка и усовершенствование существующих методов анализа ПАУ. Определенными преимуществами для определения ПАУ обладают люминесцентные, в частности флуоресцентные методы, поскольку отличительной чертой молекул ПАУ является их способность к поглощению и флуоресценции под действием УФ-излучения. Данные методы находят все большее применение в экологическом мониторинге окружающей среды. Однако обычные классические флуориметрические методы характеризуются ограниченной избирательностью (селективностью). При анализе сложных природных смесей перекрытие широких полос флуоресценции ПАУ при комнатной температуре обычно мешает процессу идентификации отдельных компонентов [2]. В случае сложных проб окружающей среды область применения флуориметрического анализа может быть расширена с помощью синхронной флуоресцентной спектрометрии [3; 4]. Концепция применения для анализа веществ синхронных спектров, получаемых при одновременном сканировании длин волн возбуждения и испускания с постоянным сдвигом: λисп - λвозб = Δλ = const, впервые была предложена Ллойдом в 1971 г. [5]. Была сформулирована методология и приведены конкретные примеры применения данного метода для определения ПАУ в многокомпонентном анализе [4]. В обзорах [6; 7] подробно описаны принципы и возможности применение синхронной спектрофлуориметрии. В работе [8] методом синхронной флуоресценции с постоянным сдвигом длин волн определялись бензо[a]пирен, бензо[b]флуорантен и бензо[k]флуорантен в смеси 16 ПАУ. Анализ смеси ПАУ методом синхронной флуоресценции в мицеллярной фазе различных неионных поверхностно-активных веществ (ПАВ) представлен в работе [9]. Об одновременном определении методом синхронной флуоресценции различных бинарных и тройных смесей ПАУ в морской воде с использованием мицеллярных сред, содержащих различные ПАВ, сообщается в работе [10]. Комбинация методов спектроскопии Шпольского и синхронной спектроскопии широко применяется при определении ПАУ в природных и техногенных средах [11]. Основное отличие синхронных спектров от обычных классических заключается в том, что они регистрируются при сканировании спектров возбуждения и испускания с постоянным сдвигом длин волн Δλ. В ряде случаев можно получить одиночный достаточно узкий пик, характерный для конкретного вещества. Такие пики регистрируются в том диапазоне длин волн, где происходит перекрытие спектров поглощения и флуоресценции. Причем оптимальные параметры ширины и интенсивности такого пика характерны для случая перекрытия максимумов соответствующих спектров. Выявлено, что интенсивность пика при синхронном сканировании спектра зависит от концентрации люминесцирующего вещества и дает возможность его количественного определения. Особенно перспективен данный метод для анализа многокомпонентного состава люминофоров с перекрывающимися классическими спектрами флуоресценции, поскольку позволяет добиться хорошего разрешения сигналов и, следовательно, дает возможность идентифицировать отдельные компоненты смеси. В результате техники синхронного сканирования не только упрощаются спектры сложных молекул, но и устраняется мешающее влияние релеевского рассеяния растворителя и в значительной степени (при соответствующем выборе Δ λ) уменьшается проявление комбинационного рассеяния растворителя, что приводит к снижению фона и, соответственно, снижению предела обнаружения. Данный метод успешно применялся для идентификации ПАУ во взвешенных частицах городского воздуха [2; 12]. В [13] описано применение синхронной флуоресцентной спектроскопии для быстрого количественного определения ПАУ в почвенных экстрактах и других твердых образцах. Пробы воды из различных источников исследуются на содержание ПАУ данным методом в [14; 15]. Целью работы является сравнительная оценка применения классического и синхронного флуоресцентных методов для анализа смеси ПАУ. Материалы и методы В работе применялись препараты ПАУ (пирен, антрацен, фенантрен, флуорен) фирмы Sigma (США). Исходные растворы ПАУ готовились по точным навескам и хранились в стеклянных пробирках с притертыми пробками в темном месте во избежание фотохимического разрушения соединений. В качестве растворителя использовались водно-мицеллярные растворы (ВМР) катионного ПАВ - цетилтриметиламмония бромида (ЦТАБ) марки «ч.д.а.» фирмы Sigma. Растворение ПАУ в растворах проводилось при помощи ультразвуковой ванны «ПСБ-4035-05» (ЗАО «ПСБ-Галс», Россия) и контролировалось по спектрам поглощения на двухлучевом сканирующем УФ-ВИД спектрофотометре ПромЭкоЛаб ПЭ-6100УФ (Россия). В рабочих растворах концентрация ЦТАБ соответствовала критической концентрации мицеллообразования (ККМ) - 9,5 · 10-4 М. Концентрация ПАУ в ВМР составляла 10-7 М. Для сорбционного концентрирования и люминесцентных исследований применялась фильтровальная нетканая гидрофобная матрица на основе вискозы («Ленфильтр», г. Санкт-Петербург). Сорбцию ПАУ на матрицу проводили в динамическом режиме в сорбционной колонке. Затем сорбент сушили 10 мин при температуре 60 °С. Флуоресценция ПАУ в растворах и на матрицах регистрировалась на спектрофлуориметре «Флуорат-02-Панорама» (Россия). Для измерения люминесценции растворов использовали стандартные кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см. Спектры флуоресценции на матрице получены с использованием специального держателя для твердых образцов. В обоих случаях использовалось фронтальное возбуждение флуоресценции образцов. Во всех экспериментальных исследованиях обязательно регистрировались фоновые сигналы матрицы, которые учитывались при построении спектров. Результаты и обсуждение В литературных источниках обсуждаются возможности применения метода синхронной спектрофлуориметрии на твердых матрицах [13; 14; 16; 17]. Сорбционное концентрирование на матрицах позволяет значительно усилить сигнал флуоресценции ПАУ [18], что также справедливо и для синхронных спектров. Подобные эксперименты по синхронному сканированию с постоянным сдвигом длин волн возбуждения и испускания были выполнены нами при использовании сорбционного концентрирования ПАУ из ВМР ЦТАБ и регистрации спектров на вискозной матрице. Следует отметить, что спектры синхронной флуоресценции изученных ПАУ на твердой вискозной матрице соответствуют аналогичным спектрам, полученным при исследовании растворов ПАУ. Упрощенный характер синхронных спектров сложных молекул является основой для простого и быстрого анализа как отдельных веществ, так и селективного метода определения индивидуальных компонентов в их смеси. Для подтверждения этого утверждения экспериментально были получены классические и синхронные спектры флуоресценции ряда растворов отдельных ПАУ и их смеси. В табл. 1 сведены длины волн максимумов в спектрах возбуждения и флуоресценции ПАУ. Таблица 1. Спектральные характеристики ПАУ / Table 1. Spectral characteristics of PAHs ПАУ / PAHs λвозб / λex λфл / λfl Фенантрен / phenanthrene 250 365 Антрацен / anthracene 250 402 Флуорен / fluorene 204 305 Пирен / pyrene 334 373 Были получены синхронные спектры флуоресценции изученных ПАУ: фенантрена, антрацена, флуорена и пирена в диапазоне Δλ от 5 до 160 нм с шагом 5 нм в интервале от 5 до 100 нм, а также с шагом 5 и 10 нм в интервале от 100 до 160 нм. Для пирена синхронные спектры представлены на рис. 1. Так как дополнительным фактором селективности может быть параметр Δλ, для каждого из изученных ПАУ экспериментально подбираются такие значения Δλ, при которых наблюдаются наиболее интенсивные и узкие пики. Изучив предварительно особенности и характеристики синхронных спектров отдельных ПАУ, подобрав для них значения Δλ и зарегистрировав положение пиков, возможно выявить характерные интенсивные пики данных компонентов уже в их смеси. При этом при одинаковом значении Δλ выявляются хорошо разрешенные пики разных компонентов. Для подтверждения данного предположения было проведено сравнительное исследование спектров твердофазной флуоресценции многокомпонентной модельной смеси ПАУ (фенантрен, антрацен, флуорен, пирен), при концентрации компонентов в диапазоне 10-8 М. Регистрировались спектры классической флуоресценции, полученные при длинах волн возбуждения, характерных для представителей данной смеси, а также синхронные спектры, с выделением наиболее интенсивных и характерных для индивидуальных ПАУ пиков. Рис. 1. Синхронные спектры флуоресценции пирена в диапазоне Δλ от 5 до 160 нм / Figure 1. Synchronous fluorescence spectra of pyrene in the Δλ range from 5 to 160 nm Первоначально для идентификации отдельных ПАУ в смеси применялось селективное возбуждение флуоресценции соответствующими длинами волн возбуждения ПАУ (см. табл. 1). При λвозб = 250 нм (рис. 2а), характерной для флуоресценции фенантрена и антрацена, наблюдается серия пиков, в которых можно различить спектры данных ПАУ. При этом максимумы интенсивности флуоресценции, наблюдаемые при 348, 365, 382 нм, свидетельствуют о присутствии в смеси фенантрена; 380, 402, 423 нм - антрацена. Однако спектры перекрываются, что осложняет достоверную идентификацию отдельных ПАУ. На рис. 2б представлены спектры флуоресценции той же смеси ПАУ, но при λвозб = 334 нм, характерной для возбуждения флуоресценции пирена. На спектре отчетливо можно выделить спектр флуоресценции пирена с максимумами при длинах волн 373 и 391 нм. Можно заключить, что избирательной идентификации пирена в данной смеси не мешает присутствие других изученных представителей этой группы соединений. Надпись: в c Надпись: б b Надпись: а а Рис. 2. Спектры флуоресценции смеси ПАУ при различных длинах волн фотовозбуждения: 250 нм (а), 334 нм (б) 204 нм (в) / Figure 2. Fluorescence spectra of PAHs mixture at different photoexcitation wavelengths: 250 nm (a), 334 nm (b) 204 nm (c) При λвозб = 204 нм (рис. 2в) получен следующий спектр данной смеси ПАУ. На спектре наблюдается пик при 305 нм, характерный для молекул флуорена. Таким образом, подбирая соответствующую длину волны возбуждения, можно селективно возбуждать флуоресценцию отдельных компонентов смеси ПАУ. Однако следует заметить, что в некоторых диапазонах длин волн есть значительное перекрывание спектров, что может затруднить идентификацию отдельных ПАУ (рис. 2а). В таком случае можно применять различные способы повышения селективности флуоресцентного метода, например синхронное сканирование спектров возбуждения и флуоресценции с постоянным сдвигом длин волн Δλ. Нами была получена серия синхронных спектров смеси ПАУ при разных Δλ в диапазоне от 5 до 160 нм. Отобраны наиболее информативные спектры. Для идентификации отдельных ПАУ в смеси проводилось сравнение положение пиков синхронных спектров индивидуальных ПАУ при той же Δλ, при которой анализировалась смесь (рис. 3). При Δλ = 55 нм в смеси ПАУ наблюдается целая серия пиков (рис. 3а). Сравнение со спектрами отдельных ПАУ позволяет выделить фенантрен (пик с вершиной на 224 нм), флуорен (пик с вершиной на 262 нм) и пирен (два пика, максимальный из которых наблюдается на 335 нм). Увеличивая Δλ до 130 нм, удается зафиксировать в синхронных спектрах смеси ПАУ пики (рис. 3б), характерные для антрацена (на длине волны 251 нм), пирена (241 и 270 нм) и фенантрена (192 нм). Надпись: б b Надпись: а а Рис. 3. Синхронные спектры флуоресценции смеси ПАУ при Δλ = 55 нм (а) и Δλ = 130 нм (б) / Figure 3. Synchronous fluorescence spectra of PAHs mixture at Δλ = 55 nm (a) and 130 nm (b) Таким образом, можно сделать вывод, что анализ синхронных спектров с разным сдвигом Δλ позволяет улучшить избирательность (селективность) флуоресцентного метода определения ПАУ в смеси. При этом важно, что для получения синхронных спектров не требуется особого оборудования, они могут быть получены на обычных спектрофлуориметрах, в которых предусмотрено одновременное (синхронное) изменение длин волн монохроматоров возбуждения и регистрации спектров флуоресценции [2]. Заключение При анализе сложных смесей ПАУ перекрытие широких полос флуоресценции обычно мешает процессу идентификации отдельных компонентов. Повысить избирательность флуоресцентного метода позволяет использование техники синхронного сканирования спектров возбуждения и флуоресценции с постоянным сдвигом длин волн Δλ. Экспериментально получены синхронные спектры флуоресценции отдельных ПАУ (пирена, антрацена, флуорена и фенантрена). Проведена сравнительная оценка анализа смеси ПАУ методом классической и синхронной флуоресценции. В итоге можно сделать вывод о том, что анализ синхронных спектров с разным сдвигом Δλ позволяет улучшить избирательность флуоресцентного метода анализа ПАУ в смеси. Флуоресцентные методы могут быть успешно применены для идентификации отдельных ПАУ при экологическом мониторинге экотоксикантов в водных объектах окружающей среды.

Об авторах

Ольга Александровна Плотникова

Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А

Автор, ответственный за переписку.
Email: plotnikovaoa@sstu.ru
ORCID iD: 0000-0003-2715-044X

кандидат химических наук, доцент, доцент кафедры «Экология и техносферная безопасность»

Российская Федерация, 510054, г. Саратов, ул. Политехническая, д. 77

Елена Ивановна Тихомирова

Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А

Email: tichomirovaei@sstu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6030-7344

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой «Экология и техносферная безопасность»

Российская Федерация, 510054, г. Саратов, ул. Политехническая, д. 77

Геннадий Васильевич Мельников

Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю.А

Email: melnikov_gv@sstu.ru
ORCID iD: 0000-0002-4708-2256

доктор химических наук, профессор, профессор кафедры «Физика»

Российская Федерация, 510054, г. Саратов, ул. Политехническая, д. 77

Список литературы