Роль нейропептидов Семакс и Селанк в модуляции клеточного звена иммунитета в условиях ожоговой травмы кожи

Полный текст

Введение

В условиях ожогового повреждения кожи морфофункциональные и дистрофические изменения затрагивают не только поврежденных участков кожи, но и органы регуляторных систем гомеостаза (нервной, иммунной, эндокринной) [1–3]. При этом запускающую роль выполняет иммунная система: в очаге воспаления незамедлительно происходит инфильтрация лейкоцитами, в связи с чем активизируются адаптивно-­восстановительные процессы в виде кооперации иммунокомпетентных клеток в иммунном ответе [4–7]. Подтверждением участия иммунной системы в процессах репаративной регенерации кожи является воспаление как тканевая реакция организма на повреждение [8–13]. Патогенез ожоговой травмы опосредован нейроиммунноэндокринными нарушениями, возникающими как проявление дисрегуляции гомеостаза при ожоговом повреждении кожи и сопровождающими течение послеожогового периода [14–16]. Это обуславливает необходимость системного подхода в стимуляции структурно-­функциональных процессов в коже при патофизиологических состояниях. Учитывая прямое реагирование иммунокомпетентных клеток в ликвидацию функциональных нарушений и иммунного дисбаланса в послеожоговом периоде [17–20], научный интерес представляет вопрос о физиологической вовлеченности и активности клеточного звена иммунитета в условиях экспериментального ожогового воздействия в ходе послеожоговой воспалительно-­регенеративной реакции и на фоне ее коррекции.

В последние годы внимание исследователей привлекает изучение фармакологических эффектов лекарственных препаратов, обладающих системным действием на фоне различных локальных дисфункциональных нарушений. К числу таких средств коррекции относят Семакс (Met-­Glu-­His-­Phe-­Pro-­Gly-­Pro) и Селанк (Thr–Lys–Pro–Arg–Pro–Gly–Pro). Доказано эффективное применение и тотипотентное действие (нейротропное, иммуномодулирующее, нейропротективное, ноотропное, психотропное) препаратов Семакс и Семакс на фоне различных стрессогенных воздействий. В литературе имеются сведения о физиологических эффектах заявленных нейропептидных препаратов, однако недостаточно данных о коррекции системных преобразований в условиях ожоговой травмы кожи. Выявление новых эффектов Семакс и Селанк вызывает научный интерес и имеет высокую практическую значимость.

Цель исследования — изучение влияния нейропептидных соединений Семакс и Селанк на функциональные возможности клеточного звена иммунитета белых крыс в условиях экспериментального ожогового воздействия.

Материалы и методы

Исследование проводили на нелинейных крысах-­самцах, которых содержали в пластиковых клетках, разделенных перегородкой, по две особи в каждой с опилковой подстилкой в условиях естественного освещения при доступе к воде и пище, при температуре воздуха  + 18–22 ˚С и влажности 60  ±  5 %. Все процедуры выполняли в соответствии с требованиями гуманного отношения к животным положений Хельсинкской декларации (1964–2013), Приказа Минздрава России № 199н от 01.04.2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» (GLP).

Рандомизация лабораторных крыс была определена следующим образом: контрольная группа — интактные животные (n = 10) и опытные группы — животные, подвергшиеся ожоговому воздействию и не получавшие средства коррекции («Ожоговая травма без коррекции») (n = 10) (на 2 и 14 сутки); животные, получавшие на фоне ожоговой раны кожи наружные аппликации и внутрибрюшинные инъекции Семакса в дозе 100 мкг/кг (n  =  10) («Ожоговая травма + Семакс»); IV группа — животные, получавшие на фоне ожоговой раны кожи наружные аппликации и внутрибрюшинные инъекции Селанка в дозе 100 мкг/кг (n = 10) («Ожоговая травма + Селанк»). Введение нейропептидных субстанций проводили наружно и внутрибрюшинно ежедневно в течение 14 дней с момента моделирования термического ожога в депилированной межлопаточной области крыс. Для оценки иммунной системы животных выводили из эксперимента на 15 сутки после термического ожога. Изучение возможной коррекционной способности нейропептидных препаратов проводили на основании показателей клеточного звена иммунитета: фагоцитарной способности нейтрофилов, количественного и процентного соотношения отдельных форм лейкоцитов.

Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по числу нейтрофилов с латексом из 100 (фагоцитарный индекс) и числу частиц латекса, разделенное на 100 (фагоцитарное число). Считали число белых кровяных клеток и процентный уровень лимфоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов.

При изучении фагоцитарной активности нейтрофилов крови крыс в фоновых условиях, в условиях ожоговой раны кожи и на фоне применения Семакса и Селанка кровь собирали при декапитации и добавляли гепарин. Дальнейшие процедуры проводили по стандартным методикам постановки реакции фагоцитоза.

Для определения содержания общего количества лейкоцитов (109/л) и процентного соотношения отдельных форм лейкоцитов, входящих в лейкоцитарную формулу крови (в %), применяли стандартные методики.

Статистический анализ результатов исследования проводили в использованием программы Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, США), применяли t-критерий Стьюдента при уровне достоверности p ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение

В условиях экспериментального ожогового воздействия наблюдали изменения фагоцитарной активности нейтрофилов, что свидетельствовало о гиперреактивности и нарушениях неспецифического звена иммунной системы. На 2 сутки после ожогового воздействия у крыс выявили увеличение значений фагоцитарного индекса (ФИ) на 60 % (p < 0,001) и фагоцитарного числа (ФЧ) на 70 % (p < 0,001) по сравнению с контрольными показателями. Через 2 недели после ожоговой травмы у крыс, не получавших средств коррекции, фагоцитарная активность сохранялась при высоких значениях и снижалась не более, чем на 10 % (p < 0,05), в отношении этих значений у животных группы «Ожоговая травма без коррекции на 2 сутки после ожога» (таблица 1).

Введение внутрибрюшинных инъекций нейропептидного препарата Семакс при ожоговой травме кожи приводило к снижению показателей фагоцитарной активности нейтрофилов — фагоцитарного числа на 15 % (p > 0,05) по сравнению с группой «Ожоговая травма без коррекции на 2 сутки», а также на 10 % (p < 0,05) по сравнению с группой «Ожоговая травма без коррекции на 14 сутки».

На фоне применения Селанка в условиях ожоговой травмы кожи происходило уменьшение фагоцитарной способности клеток на 20 % (p < 0,01) по сравнению с группой «Ожоговая травма без коррекции на 2 сутки» и на 15 % (p > 0,05) по сравнению с группой «Ожоговая травма без коррекции на 14 сутки».

Фагоцитарный индекс при действии Семакса уменьшился на 15 % (p > 0,05), а при влиянии Селанка — на 25 % (p > 0,01), по сравнению с группой «Ожоговая травма без коррекции на 2 сутки». Анализируя изменения относительно группы «Ожоговая травма без коррекции на 14 сутки», также установлены достоверные различия, свидетельствующие о нейропептидной коррекции нарушений фагоцитарной активности нейтрофилов (таблица 1).

Таблица 1/ Table 1
Оценка влияния Семакса и Селанка на фагоцитарную активность нейтрофилов в условиях ожоговой травмы кожи/
Assessment of the Effect of Semax and Selank on Phagocytic Activity of Neutrophils in the Context of Burn Injury of skin

Экспериментальные группы (n = 10)/ Animal Group (n  =  10)	Контроль/ Control	«Ожоговая травма без коррекции (ОТ)» на 2 сутки после ожога [21] / «Burn of skin» 2 day after burn [21]	«Ожоговая травма без коррекции (ОТ)» на 14 сутки после ожога/ «Burn of skin» 14 day after burn	«ОТ + Семакс» на 14 сутки после ожога/«Burn of skin  + Semax» 14 day after burn	«ОТ + Селанк» на 14 сутки после ожога/«Burn of skin + Selank» 14 day after burn
Показатели (M   ±   m)/  Indicators (M    ±   m)
Фагоцитарный индекс, %/phagocytic index (FI), %	13,7  ±  2,4	22,9  ±  2,8***	22,3  ±  1,3*	21,6  ±  1,4*##	18,4  ±  1,8*##
Фагоцитарное число/phagocytic number (FF)	21,3   ±   3,1	37,1  ±  3,7***	34,6  ±  4,8**	32,8  ±  5,6**#	29,6  ±  3,4**#

Примечание: * — p < 0,05; ** — p < 0,01; *** – p < 0,001 — относительно группы «Контроль», # — p < 0,05; ## — p < 0,01; ### — p < 0,001 — относительно группы «Ожоговая травма без коррекции на 2 сутки» (t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони)
Note: * — p  <  0.05; ** — p < 0.01; * * * — p <  0.001 — relative to control # — p < 0,05; ## — p < 0,01; ### — p < 0,001 — relative to the Untreated Burn Injury group 2 day after burn (Student’s t-test with Bonferroni correction for multiple comparisons).

Рис. 1. Общее число лейкоцитов влияния в фоновых условиях, в условиях ожоговой травмы и на фоне коррекции нейропептидными препаратами Семакс и Селанк
Fig. 1. Total Number of White Blood Cells of Influence in Background, Burn Injury, and Neuropeptide Treatment with Semax and Selank

Анализируя показатели лейкоцитарной формулы, выявлено, что ожоговое воздействие инициировало увеличение общего числа лейкоцитов в периферической крови в 2,5 раза (p < 0,001) (рис. 1).

Было выявлено изменение показателя лейкоцитарного коэффициента в 2 раза (p < 0,001), относительно значений контрольной интактной группы. На фоне применения Семакса и Селанка данный показатель равнозначно и достоверно снижался на 60 % (p < 0,01) по сравнению с группой «Ожоговая травма без коррекции на 2 сутки». Сравнивая показатели лейкоцитарного коэффициента групп «Ожоговая травма без коррекции на 14 сутки после ожога», Ожоговая травма + Семакс», «Ожоговая травма + Селанк», отмечено, что введение нейропептидных препаратов способствовало снижению его значений в среднем на 40 % (p < 0,001) (рис. 2).

Рис. 2. Значение лейкоцитарного коэффициента в фоновых условиях, в условиях ожоговой травмы и на фоне коррекции нейропептидными препаратами Семакс и Селанк
Fig. 2. Value of leukocytic coefficient of Influence in Background, Burn Injury, and Neuropeptide Treatment with Semax and Selank

На 2 сутки термической травмы кожи крыс в периферической крови наблюдали увеличение числа палочкоядерных лейкоцитов и лимфоцитов по сравнению с контролем. Число эозинофилов и сегментоядерных нейтрофилов резко уменьшалось [21] (табл. 2).

Таблица 2/ Table 2

Оценка влияния Семакса и Селанка на показатели лейкоцитарной формулы в условиях ожоговой травмы кожи/ Assessment of the Effect of Semax and Selank on the Leukocyte Formula in the Context of Burn Injury of skin

Экспериментальные группы (n = 10)/Animal Groups (n =  10) Показатели (M  ±   m)/ Indicators (M   ±   m)	Контроль [21]/ Control [21]	«Ожоговая травма без коррекции (ОТ)» на 2 сутки после ожога [21] /«Burn of skin» 2 day after burn [21]	«Ожоговая травма без коррекции (ОТ)» на 14 сутки после ожога/ «Burn of skin» 14 day after burn	«ОТ + Семакс» на 14 сутки после ожога/ «Burn of skin + Semax» 14 day after burn	«ОТ + Селанк» на 14 сутки после ожога/ «Burn of skin + Selank» 14 day after burn
Эозинофилы, %/Eosinophils,%	6,2  ±   0,7	1,4  ±  0,2**	2,6  ±  0,8**	4,2  ±  0,3**	4,8  ±  0,1**
Палочкоядерные нейтрофилы, %/ Stick‑nuclear neutrophils,%	5,2   ±   0,5	15,4  ±  1,5***	12,4  ±  1,5*	8,0  ±  0,4***	7,5  ±  0,6***
Сегментоядерные нейтрофилы, %/ Segmentonuclear neutrophils, %	17,4   ±   1,3	6,4  ±  0,6**	9,4  ±  0,7**	12,5  ±  0,2**	13,0  ±  0,3**
Лимфоциты, %/Lymphocytes, %	70,3   ±   5,9	73,8  ±  1,3**	59,4  ±  7,6**	60,5  ±  0,6**	67,3  ±  0,6**
Моноциты,%/Monocytes, %	2,0   ±  0,2	1,0  ±  0,2*	2,1   ±  0,3**	2,4  ±  0,1*	1,8  ±  0,2*

Примечание: * — p < 0,05; ** — p < 0,01; *** – p < 0,001 — относительно группы «Контроль», # — p < 0,05; ## — p < 0,01; ### — p < 0,001 — относительно группы «Ожоговая травма без коррекции на 2 сутки» (t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони)
Note: * — p < 0.05; * * — p < 0.01; * * * — p < 0.001 — relative to control # — p < 0,05; ## — p < 0,01; ### — p < 0,001 — relative to the Untreated Burn Injury group 2 day after burn (Student’s t-test with Bonferroni correction for multiple comparisons).

В условиях ожогового воздействия без применения средств коррекции в течение 14 дней наблюдали тенденцию к снижению увеличенных показателей и восстановлению до исходных значений. Общее число лейкоцитов, лимфоцитов, палочкоядерных нейтрофилов снижалось в среднем на 25 % (p < 0,05). Количество эозинофилов и белых клеток, имеющих ядра в виде сегментов, уменьшалось на 85 % (p < 0,001) и на 47 % (p < 0,01), соответственно, в отношении значений группы «Ожоговая травма без коррекции на 2 сутки» [21].

В условиях ожога кожи и коррекции соединениями Семакс и Селанк происходило восстановление клеточного звена иммунитета. Семакс приводил к снижению общего количества лейкоцитов на 45 % (p < 0,01), а Селанк — к их уменьшению на 48 % (p < 0,01). Наружные аппликации и внутрибрюшинные инъекции нейропептидных препаратов способствовали снижению числа палочкоядерных нейтрофилов на 50 % (p < 0,01) и восстановлению числа сегментоядерных нейтрофилов на 30 % (p < 0,05) до нормальных контрольных показателей по сравнению с группой животных с термической травмой на 2 сутки без применения средств коррекции.

Выводы

Результаты проведенного исследования показали, что в условиях ожоговой травмы кожи происходили нарушения со стороны иммунной системы в виде активации и супрессии ее звеньев. Причем изменения клеточного звена иммунитета носили хронозависимый характер. На 2 сутки после ожоговой травмы кожи выявлено повышение фагоцитарной активности нейтрофилов, увеличение лейкоцитарного коэффициента. В недельный период после ожога отмечены лимфоцитоз, моноцитоз и нейтрофилез. В течение двух недель после послеожогового процесса установлено повышение фагоцитарной активности нейтрофилов и увеличение лейкоцитарного коэффициента.

На фоне применения нейропептидных соединений в условиях ожоговой раны кожи в течение 14 дней выявлены дисфункциональные преобразования иммунокомпетентных клеток, свидетельствующие о нейропептидной коррекции нарушений фагоцитарной активности нейтрофилов и лейкоцитарной реакции.

Таким образом, внутрибрюшинное введение Семакса и Селанка при ожоговом повреждении кожи подтверждало комплексное их влияние на системные нарушения на фоне локального стрессового воздействия, что указывало на проявление иммунокорригирующего эффекта.

Об авторах

А. К. Ажикова

Астраханский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: alfia-imacheva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9758-1638
SPIN-код: 1245-3158
г. Астрахань, Российская Федерация

М. А. Самотруева

Астраханский государственный медицинский университет

Email: alfia-imacheva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5336-4455
SPIN-код: 5918-1341
г. Астрахань, Российская Федерация

Л. А. Андреева

Институт молекулярной генетики Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Email: alfia-imacheva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3927-8590
SPIN-код: 4785-5621
г. Москва, Российская Федерация

Н. Ф. Мясоедов

Институт молекулярной генетики Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»

Email: alfia-imacheva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4168-4851
SPIN-код: 1262-2698
г. Москва, Российская Федерация

Список литературы

Дополнительные файлы