Иммунологические и иммуногистохимические особенности имплантационного фактора эндометрия у здоровых пациенток позднего репродуктивного возраста

Полный текст

Введение

Несмотря на то, что вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) являются эффективными методом преодоления бесплодия, лечение пациенток старшего репродуктивного возраста остается низко результативным. Так, по данным отчета регистра ВРТ за 2020 год в группе 35–39 лет частота наступления беременности в цикле экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) с расчетом на пункцию составила 22,3 %, частота родов — 16,6 %, тогда как у женщин 34 года и моложе (26,8 % и 20,8 % соответственно). Частота наступления беременности в группе женщин 40 лет и старше была более чем в 2 раза ниже (ЭКО — 11,5 %), а частота завершения беременностей родами у данной возрастной группы ниже в 3 раза (6,5 %). Эти параметры более чем вдвое повышаются при проведении предимпланционной генетической диагностики (ПГД) или при переносе размороженного эмбриона, что безусловно подтверждает ведущую роль эмбрионального фактора в исходах ВРТ. Однако число женщин старшего репродуктивного возраста, со снижением естественной фертильности, обратившихся в клиники ВРТ, неуклонно растет, а повторяющиеся неудачи программ ВРТ у пациенток с бесплодием при переносе эмбрионов высокого качества указывают на то, что причиной могут быть нарушения процессов имплантации эмбриона, связанные с нарушением рецептивности и функциональности эндометрия [1–3]. Морфологические, иммунологические и иммуногистохимические изменения в эндометрии, связанные с возрастным фактором, могут оказаться определяющими для формирования «окна имплантации», и коррекция этих изменений, возможно, улучшит исходы ВРТ для когорты пациенток старшего репродуктивного возраста.

Цель исследования — расширить патогенетические представления о нарушении имплантационной способности эндометрия у здоровых пациенток старшего репродуктивного возраста.

Материалы и методы

На базе отделений репродуктологии Краснодарского края в период 2018–2022 г г. проведено проспективное выборочное исследование 46 пациенток (1 группа) в возрасте от 38 до 45 лет с официально зарегистрированным диагнозом «бесплодие» длительностью не более 4 лет, с благополучным гинекологическим и акушерским анамнезом, которым предстояла первая попытка ЭКО. Поздняя попытка реализации репродуктивной функции у всех обследуемых пациенток была вызвана социальными факторами (получение образования, карьера, достижение определенного общественного и финансового статуса, отсутствие полового партнера, позднее вступление в половую жизнь, повторный брак). Контрольную группу (2 группа) (инструментальный и лабораторный контроль) составили 50 здоровых женщин 25–34 лет, наблюдающихся в связи с мужским фактором бесплодия.

Критерии включения в основную группу: возраст пациенток в диапазоне 35–45 лет; наличие показаний к ЭКО; сохраненная функция яичников и менструальный цикл; фертильная сперма партнера; нормальный кариотип у супругов; получение добровольного информированного согласия пациенток в соответствии с Хельсинской декларацией на проведение лабораторно- инструментального, гистологического и иммуногистохимического исследования, проведения процедур ВРТ и обработку персональных данных.

Критерии исключения: возраст менее 38 лет и более 45 лет; противопоказания к ЭКО, миома матки; эндометриоз; наличие в анамнезе воспалительных заболеваний половых путей, хламидиоза и внематочной беременности, мужской фактор бесплодия, нарушения в кариотипе супругов.

Все пациентки были обследованы согласно приказу № 803н Минздрава РФ. Для оценки фолликулярного резерва проводилось исследование уровня фолликулостимулирующего гормона и антимюллерова гормона в сыворотке крови на 2–5 день менструального цикла и оценка количества антральных фолликулов с помощью ультразвукового исследования трансвагинальной методикой при помощи аппарата «Toshiba Aplio 500» (Toshiba, Япония). Исследовался уровень эстрадиола и прогестерона методом иммуно-ферментного анализа (ИФА), с использованием реагентов 100–02 Стероид ИФА-прогестерон № 100–03 (Алкор Био, Санкт-Петербург, Россия) и Estradiol ELISA KIT- 2693 (DRG International, NJ, USA).

Для оценки имплантационного фактора эндометрия проводилась ультразвуковая оценка толщины эндометрия на 19–21 дни менструального цикла, иммуногистохимическое исследование материала полученного пайпель-биопсией с определением в тканях эндометрия рецепторов к прогестерону, эстрогену, HLA-DR (MHC II), CD56 (NK-клетки), CD138, фактора, ингибирующего лейкемию (LIF). Забор цервикальной слизи (ЦС) производился в средней секреторной фазе (19–22 день менструального цикла) с использованием флоковых тампонов (Medschenker, Южная Корея). Концентрации IL-6, IL-10, TGFβ, VGEF в цервикальном секрете определялись твердофазным иммуноферментным методом (ТИФА) с использованием наборов (Caltag Laboratories, USA). Проводился расчет провоспалительного индекса, как отношение IL-6/IL-10 у. е. и соотношение TGFβ1/VEGF, у. е.

Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Описание качественных признаков представлено в виде абсолютных (количество) и относительных (удельный вес, %) данных, количественных признаков в зависимости от варианта распределения признака: по одновыборочному критерию Колмогорова — Смирнова представлено в виде средних значений ± стандартное отклонение, сравнение количественных данных в зависимости от вида распределения проводили с помощью параметрических или непараметрических методов: t-теста Стьюдента или U-критерия Манна — Уитни. Во всех случаях критический уровень значимости принимался за р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Средний возраст всех обследованных женщин равнялся 39,9 ± 2,1 года. Средний возраст пациенток группы контроля составил 30,0 ± 2,6 лет.

Общая средняя продолжительность официально документированного бесплодия у пациенток 1 группы составила 3,02 ± 0,8 лет. Среди пациенток 1 группы преобладало первичное бесплодие — 37 (80,4 %) пациенток, вторичное бесплодие отмечалось у 9 (19,6 %). У 8 (17,6 %) пациенток в анамнезе были срочные роды, а у 9 (19,6 %) — медикаментозные артифициальные аборты.

При сборе гинекологического анамнеза у пациенток основной группы отмечены дисбиозы и инфекции, передаваемые половым путем (ИППП) (70,9 % пациенток), эктопия цилиндрического эпителия на шейке матки (23,9 % пациенток), тогда как других гинекологических заболеваний не отмечалось. Соматический анамнез у пациенток также не был отягощен заболеваниями, влияющими на возможность реализации репродуктивной функции.

Все женщины прошли обследование в соответствии с приказом № 803н Минздрава РФ. В основное обследование включали общий анализ крови, мочи, биохимическое исследование, определение уровня половых гормонов, ультразвуковое исследование женских половых органов в динамике менструального цикла.

Концентрация гонадотропных и стероидных гормонов практически у всех пациенток находилась в пределах референсной нормы, включая тиреотропный гормон, пролактин, индекс свободных андрогенов. Однако при сравнении показателей основной (1 группа) и контрольной группы (2 группа) были обнаружены достоверные различия, полученные при использовании Т-критерия для независимых выборок, поскольку нормальность распределения по критерию Колмогорова— Смирнова не отвергалась (p > 0,05).

Уровни лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) были статистически значимо ниже у пациенток 1 группы (р < 0,001) (табл. 1). Повышенные базальные значения ЛГ и ФСГ могут быть критичными для нормальной овуляции и для правильной синхронизации состояния оплодотворенного ооцита и статуса эндометрия. При этом концентрация эстрадиола, который имеет чрезвычайно высокое значение для реализации функции фертильности не имела статистически значимых различий между группами (р = 0,85).

Таблица 1. Концентрация гонадотропных и стероидных гормонов в периферической крови у пациенток основной и контрольной групп (М ± m)

Показатель	1 группа, n = 46	2 группа (контроль), n = 50	р
ЛГ, ME/л	7,45 ± 3,2	8,55 ± 3,4	0,003
ФСГ, ME/л	8,82 ± 1,6	5,13 ± 1,3	0,008
Эстрадиол, пмоль/л	297,1 ± 14,4	283,6 ± 67,3	0,85
Прогестерон, нмоль/л	28,56 ± 15,8	34,86 ± 18,3	0,003
АМГ, нг/мл	1,62 ± 0,8	5,6 ± 1,8	< 0,001
Мелатонин, пг/мл	4,1 ± 1,81	5,7 ± 1,2	0,005

Примечание: ЛГ — лютеинизирующий гормон;  ФСГ — фолликулостимулирующий гормон; АМГ — антимюллеров гормон

Table 1. Concentration of gonadotropin and steroid hormones in peripheral blood in patients of the main and control groups (M ± m)

Indicator	1 group, n = 46	2 group (control), n = 50	р
LG, ME/L	7.45 ± 3.2	8.55 ± 3.4	0.003
FSG, ME/l	8.82 ± 1.6	5.13 ± 1.3	0.008
Estradiol, pmol/l	297.1 ± 14.4	283.6 ± 67.3	0.85
Progesterone, pmol/l	28.56 ± 15.8	34.86 ± 18.3	0.003
AMG, ng/ml	1.62 ± 0.8	5.6 ± 1.8	< 0.001
Melatonin, pg/ml	4.1 ± 1.81	5.7 ± 1.2	0.005

Note: LH — luteinizing hormone; FSH — follicle- stimulating hormone; AMH is anti- Mullerian hormone

Прогестерон важен для формирования адекватной секреторной фазы эндометрия и полноценного окна имплантации, под его воздействием активированными лимфоцитами продуцируется прогестерон- индуцированный блокирующий фактор (PIBF), который выполняет иммуномодулирующие функции, важные для установления процессов иммунной толерантности между организмами матери и плода [4–6]. При этом сниженная концентрация прогестерона приводит к многообразным дефектам секреторной фазы эндометрия, что уменьшает частоту успешных имплантаций. Исследованиями показано, что средние значения уровня прогестерона крови, определяемого на 19–24 день менструального цикла, в первой группе пациенток были значимо снижены относительно второй группы (р < 0,001).

Исследование антимюллерова гормона (АМГ), который наряду с уровнем ФСГ и количеством антральных фолликулов в яичнике является параметром овариального резерва, показало, что по сравнению с группой контроля в первой группе обследуемых наблюдалось статистически значимое снижение его средних значений (1,62 ± 0,81 пг/мл против 5,6 ± 1,8 пг/мл, p < 0,001). При этом уровень АМГ коррелировал с возрастом пациенток (р = 0,93), поскольку наиболее низкие уровни наблюдались у пациенток старше 40 лет. Между тем известно, что АМГ имеет тесную корреляционную связь с количеством ооцитов, полученных в результате стимуляции суперовуляции. Пациентки с низким уровнем АМГ стандартно слабо реагируют на стимуляцию и, следовательно, имеют низкую вероятность наступления беременности с собственными яйцеклетками [7–9].

Изучение роли мелатонина и его взаимосвязь с нарушением фертильной функции в возрастном аспекте представляется чрезвычайно важным, так как мелатонин оказывает подавляющее действие непосредственно на гипофиз, а возрастное снижение мелатонина сигнализирует о расстройстве пинеального и гипофизарного контроля над яичниковой цикличностью и прогрессивном угасании фертильной функции женщины [10–12]. По данным нашего исследования уровень мелатонина периферической крови у пациенток старшего репродуктивного возраста был статистически значимо снижен по сравнению с группой контроля (4,1 ± 1,81 пг/мл против 5,7 ± 1,2 пг/мл в контрольной группе, р = 0,005).

Одним из методов исследования состояния эндометрия является допплерометрическое исследование характера кровотока в сосудах матки. Измерение таких допплерометрических показателей кровотока, как PI и RI маточных сосудов, может быть использовано для прогноза возможности наступления беременности в циклах ЭКО. Значения PI, меньшие или равные 3,0, являются прогностически благоприятными факторами в циклах ЭКО [13–15].

Ультразвуковое исследование с применением допплеровского картирования выявило статистически значимую межгрупповую разницу по следующим параметрам: в 1 группе наблюдалось уменьшение толщины эндометрия как в первой, так и во второй фазе цикла, было уменьшено количество антральных фолликулов и у всех пациенток наблюдался высокорезистентный кровоток в маточной артерии (табл. 2) при PI маточных артерий 3,42 ± 0,1, что является прогностически неблагоприятным фоном для имплантации эмбриона.

Таблица 2. Данные ультразвукового и допплерометрического исследования женских половых органов обследуемых пациенток

Параметры	1 группа, n=46		2 группа (контроль), n = 50		р	р
Дни менструального цикла	5–7	19–21	7–8	19–21	5–7	19–21
Длина тела матки, мм	53 ± 1,3	54 ± 2,1	52 ± 1,2	53 ± 1,4	0,453	0,564
Переднезадний размер, мм	38 ± 1,4	44 ± 2,1	38 ± 1,2	40 ± 1,3	0,458	0,598
Ширина, мм	51 ± 1,1	56 ± 1,5	51 ± 1,2	52 ± 1,2	0,376	0,789
Толщина эндометрия	6,2 ± 0,9	7,48 ± 2,24	9,4 ± 1,3	13,3 ± 1,67	< 0,001	< 0,001
Количество антральных фолликулов	3,7 ± 1,3	-	7,6 ± 0,01	-	< 0,001	-
R med маточных артерии	-	9,5 ± 0,01	-	7,9 ± 0,01	-	< 0,001
IR med маточных артерии	-	0,95 ± 0,04	-	0,85 ± 0,04	-	< 0,001
PI маточных артерий	-	3,42 ± 0,1		2,22 ± 0,01	-	< 0,001

Table 2. Data of ultrasound and Doppler examination of female genital organs of the examined patients

Indicator	1 group, n=46		2 group (control), n=50		р	р
Day of the menstrual cycle	5–7	19–21	7–8	19–21	5–7	19–21
Length of the uterus body, mm	53 ± 1.3	54 ± 2.1	52 ± 1.2	53 ± 1.4	0.453	0.564
Front-rear size, mm	38 ± 1.4	44 ± 2.1	38 ± 1.2	40 ± 1.3	0.458	0.598
Width, mm	51 ± 1.1	56 ± 1.5	51 ± 1.2	52 ± 1.2	0.376	0.789
Endometrial thickness	6.2 ± 0.9	7.48 ± 2.24	9.4 ± 1.3	13.3 ± 1.67	< 0.001	< 0.001
Number of antral follicles	3.7 ± 1.3	-	7.6 ± 0.01	-	< 0.001	-
R med of uterine arteries	-	9.5 ± 0.01	-	7.9 ± 0.01	-	< 0.001
IRmed Uterine arteries	-	0.95 ± 0.04	-	0.85 ± 0.04	-	< 0.001
PI of the uterine arteries	-	3.42 ± 0.1		2.22 ± 0.01	-	< 0.001

Анализ приведенных данных показывает, что у пациенток старшего репродуктивного возраста, в отсутствии гинекологических заболеваний по совокупности с дисгормонозом имеются гемодинамические нарушения в сосудистой сети матки, что вероятно вызывает обеднение васкуляризации эндометрия и субэндометриальной зоны, что целом отражается на толщине эндометрия, которая является маркером имплантационных возможностей. Иммуногистохимическое исследование эндометрия в период «окна нидации» с оценкой рецептивности эндометрия, воспалительных маркеров и эндометриальных факторов позволяет дать комплексное заключение о составляющих эндометриальной дисфункции у обследуемых пациенток.

В результате анализа практически всех параметров обследования у пациенток старшего репродуктивного возраста выявлены статистически значимые отклонения от группы контроля. Экспрессия рецепторов половых гормонов, как к эстрогену так и к прогестерону, была понижена по сравнению с аналогичными показателями во 2 группе (р < 0,001) (табл. 3), а так же статистически значимо была снижена экспрессия рецепторов к цитокину LIF, непосредственно обеспечивающему имплантацию.

Таблица 3. Иммуногистохимические параметры эндометрия

Показатель	1 группа, n = 46 (исходно)	2 группа (контроль), n = 50	р 1–2 группы
ER КЖЭ M ± SD	111,71 ± 41,24	134,05 ± 40,47	< 0,001
ER КС M ± SD	115,84 ± 27,32	141,56 ± 30,02	< 0,001
PR КЖЭ M ± SD	156,55 ± 36,48	174,50 ± 28,06	< 0,001
PR КС M ± SD	155,92 ± 33,39	172,86 ± 29,52	< 0,001
LIF КЖЭ M ± SD	16,8 ± 6,34	26,04 ± 6,89	< 0,001
LIF КС M ± SD	17,36 ± 4,45	28,00 ± 4,35	< 0,001
HLA-DR (MHC II) M ± SD	8,36 ± 4,65	8,91 ± 4,52	0,126
CD56 (NK-клетки) M ± SD	11,06  ± 3,15	6,41 ± 3,10	< 0,001
CD138 (плазмоциты) M ± SD	2,03 ±  0,82	1,01 ± 0,85	< 0,001

Примечание: КЖЭ — клетки железистого эпителия; КС — клетки стромы; LIF — фактор, ингибирующий лейкемию

Table 3. Immunohistochemical parameters of the endometrium

Indicator	1 group,  n = 46  (initially)	2 group (control), n = 50 p	p 1–2 groups
ER GEC M ± SD	111.71 ± 41.24	134.05 ± 40.47	< 0.001
ER SC M ± SD	115.84 ± 27.32	141.56 ± 30.02	< 0.001
PR GEC M ± SD	156.55 ± 36.48	174.50 ± 28.06	< 0.001
PR SC M ± SD	155.92±33.39	172.86 ± 29.52	< 0.001
LIF GEC M ± SD	16.8±6.34	26.04±6.89	< 0.001
LIF SC M ± SD	17.36 ± 4.45	28.00 ± 4.35	< 0.001
HLA-DR (MHC II) M ± SD	8.36 ± 4.65	8.91±4.52	0.126
CD56 (NK-cells) M ± SD	11.06 ± 3.15	6.41 ± 3.10	< 0.001
CD138 (plasmocytes) M ± SD	2.03 ± 0.82	1.01 ± 0.85	< 0.001

Note: GEC — glandular epithelial cells; SC — stroma cells; LIF — leukemia inhibiting factor

Параллельно у 37 (80,4 %) пациенток старшего репродуктивного возраста (1 группа), в отсутствии позитивных анализов на инфекционные агенты, были выявлены признаки хронического эндометрита с аутоиммунным компонентом, без активации процесса, что подтверждалось наличием соответствующего количества клеток, экспрессирующих CD56 + — 11,06 ± 3,15 и количеством клеток, экспрессирующих HLA-DR(II) + 8,36  ±  4,65. У пациенток группы контроля наблюдался нормальный рецепторный гормональный статус, маркеры хронического эндометрита выявлены не были.

Наличие хронического аутоимунного воспалительного процесса у пациенток 1 группы подтверждалось активацией провоспалительных реакций цитокинового каскада, определяемого в цервикальном секрете. Так, провоспалительный индекс (ПВИ) цервикальной слизи у пациенток старшего репродуктивного возраста превышал показатель в группе контроля более чем в 1,5 раза за счет увеличения уровня IL6 (табл. 4). Недостаточная васкуляризация эндометрия у пациенток 1 группы, определяемая показателями допплерометрии, коррелировала со статистически значимо (р < 0,001) уменьшенной экспрессией (р < 0,001) сосудисто- эндотелиального фактора (VEGF) (r = 0,98) и статистически значимо увеличенной экспресией β-трансформирующего фактора роста (TGF-β), белкового фактора, стимулирующего процесс фиброза (r  =  0,97). Преобладание процессов фиброза над процессами ангиогенеза у пациенток 1 группы подтверждалось статистически значимым увеличением соотношения TGFβ1/VEGF до 2,4 ± 0,9 у.е, по сравнению с группой контроля (2 группа) — 0,95 ± 0,1 у.е, р < 0,001 (табл. 4).

Таблица 4. Цитокины и факторы роста в цервикальном секрете (ЛГ + 7, (пг/ мл) (M ± SD))

Показатель	1 группа, n = 46 (исходно)	2 группа  (контроль), n = 50	р  1–2 группы
ПВИ (IL6 / IL10)	1,2 ±  0,1	0,73 ± 0,1	0,982
LIF	17,12 ± 6,8	33,4 ± 8,5	< 0,001
VEGF	28,1 ± 4,4	56,3 ± 4,2	0,913
TGFβ1	76,3 ± 5,3	54,3 ± 5,4	0,87
TGFβ1 / VEGF-А	2,4 ± 0,9	0,95 ± 0,1	< 0,001

Примечание: ПВИ — провоспалительный индекс

Table 4. Immunohistochemical parameters of the endometrium  (LH + 7, (pg/ml) (M ± SD))

Indicator	1 group, n = 46 (initially)	2 group (control), n = 50 p	p 1–2 groups
PII (IL6/ IL10)	1.2 ± 0.1	0.73 ± 0.1	0.982
LIF	17.12 ± 6.8	33.4 ± 8.5	< 0.001
VEGF	28.1 ± 4.4	56.3 ± 4.2	0.913
TGFβ1	76.3 ± 5.3	54.3 ± 5.4	0.87
TGFβ1/  VEGF-А	2.4 ± 0.9	0.95 ± 0.1	< 0.001

Note: PII- pro-inflammatory index

Выводы

Таким образом, по данным нашего исследования в группе здоровых пациенток старшего репродуктивного возраста наблюдается дисбаланс экспрессии стероидных рецепторов эндометрия и секреторной трансформации эндометрия на фоне нормальных уровней стероидных гормонов с наличием относительной гиперэстрогении при снижении рецепции к собственным гормонам в строме и железистой ткани эндометрия. Снижение мелатонина сигнализирует о расстройстве пинеального и гипофизарного контроля над яичниковой цикличностью. Отмечается уменьшение экспрессии фактора, ингибирующего лейкемию (LIF), обеспечивающего имплантационные свойства эндометрия. Отслеживаются признаки неактивного хронического эндометрита с аутоиммунным компонентом, подтверждающиеся провоспалительным цитокиновым балансом. Преобладание процессов фиброза над процессами ангиогенеза подтверждается увеличением соотношения TGFβ1/VEGF. Так как сосудистое русло и эндометрий является мишенью для стероидных гормонов яичников и факторов роста, возможно, вследствие данных процессов у пациенток старшего репродуктивного возраста в отсутствие отягощенного акушерско-гинекологического анамнеза и каких-либо гинекологических заболеваний наблюдается высокорезистентный кровоток в маточных артериях и соответствие эхоструктуры эндометрия фазе менструального цикла. Стандартная прегравидарная подготовка, заключающаяся в циклической гормональной терапии или поддержке секреторной фазы менструального цикла, при всей патогенетической обусловленности не может обеспечить компенсацию всех факторов, нарушающих имплантационный потенциал эндометрия у данной когорты пациенток, и требует разработки новых комплексных методик, непосредственно влияющих на многообразие всех факторов, обеспечивающих естественное угасание репродуктивного потенциала, с целью повышения эффективности программ ВРТ.

Об авторах

Е. И. Кравцова

Кубанский государственный медицинский университет

Email: nvk24071954@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8987-7375
Краснодар, Российская Федерация

Н. В. Колесникова

Кубанский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: nvk24071954@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9773-3408
Краснодар, Российская Федерация

И. Н. Лукошкина

Кубанский государственный медицинский университет

Email: nvk24071954@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6214-8404
Краснодар, Российская Федерация

К. В. Урюпина

Кубанский государственный медицинский университет

Email: nvk24071954@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8113-2790
Краснодар, Российская Федерация

В. А. Авакимян

Кубанский государственный медицинский университет

Email: nvk24071954@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4946-6640
Краснодар, Российская Федерация

Список литературы