Study of Ki-67 expression in transplanted fat graft in rats

Full Text

Введение

Аутотрансплантация жира завоевала широкую популярность в пластической хирургии для коррекции контуров мягких тканей, восполнения потери ее объемов и омоложения кожи, однако проблема потери объема после трансплантации остается все еще актуальной. В последние годы были разработаны новые стратегии, которые несколько улучшили результаты липофилинга и трансплантации жировой ткани. Вопрос сохранения жирового трансплантата все еще требует дальнейших исследований. Это открывает новые возможности в изучении механизмов регенерации стволовых клеток жировой ткани в реципиентном месте после трансплантации жира. Значение белка экспрессии Ki‑67, апоптоза, макрофагов, которые тесно связаны с локальной микросредой и регенерацией тканей, становится все более важной в контексте пересадки жира [1–4].

Изучение активности стволовых клеток жировой ткани и стромально-­васкулярной фракции может стать новым этапом в понимании методов улучшения приживаемости жировых трансплантатов и их последующей сохранности в месте пересадки [5]. Белок Ki‑67 на протяжении десятилетий используется в качестве маркера пролиферации опухолевых клеток человека. В процессе митоза Ki‑67 играет ключевую роль в формировании перихромосомного слоя — рибонуклеопротеиновой оболочки, которая покрывает конденсированные хромосомы. В этой структуре Ki‑67 предотвращает агрегацию митотических хромосом, обеспечивая их правильное разделение [6].

Для лучшего понимания нормальных митотических и пролиферативных процессов в жировом аутотрансплантате при различных методах его обработки возможна оценка экспрессии белка Ki‑67 в жировой ткани и тканях, окружающих жировой трансплантат.

Цель исследования. Оценить экспрессию Ki‑67 в жировых аутотрансплантатах как маркера пролиферации на отдаленных сроках у крыс.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Исследование было проведено на 65 половозрелых крысах-­самцах линии Wistar. Контроль-­негативную группу интактных животных составили 5 крыс, которым не проводилось никаких манипуляций (1 группа, n  =  5). Во 2‑й группе (контроль-­позитивная, n  =  15) иглой 25G (D  =  0.5 мм) в участок кожи на холке площадью 1 см² внутрикожно 6‑кратно вводили 0,05 мл 0,9 % раствор хлорида натрия. В третьей группе (n  =  15) вводился аутотрансплантат цельной необработанной жировой ткани размером 2×4×3 мм (1,2  ±  0,5 мг) в область холки через разрез длиной 5 мм. В четвертой группе (n = 15) проводилась трансплантация предварительно измельченной скальпелем собственной жировой ткани 1×2×1 мм (1,33  ±  0,47 мг). Крысам данной группы в область холки через разрез 0,5 см вводили предварительно измельченную скальпелем жировую ткань. В пятой группе (n  =  15) через иглу 20G (D = 1 мм) в области холки внутрикожно вводили препарат собственной жировой ткани после предварительной ее обработке в шприце Луер Лок (2 мл) с последовательной сменой насадок с диаметром отверстий от 2,4 мм до 0,2 мм. Критерием готовности материала была его способность проходить через иглу шприца диаметром 0,6 мм. Объем одной инъекции составлял 0,05 мл посредством 6‑ти инъекций на площадь 1 см². Жировая ткань у всех крыс извлекалась из паховой области (Рисунок 1) и промывалась охлажденным 0,9 % раствором хлорида натрия, после чего обрабатывалась одним из указанных методов. Оценивали количество клеток с экспрессией Ki‑67 в месте трансплантированного жира и толщину жировых графтов.

Эксперименты выполнены в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU. Исследование одобрено локальным Комитетом по этике медицинского института РУДН, протокол № 02–24 от 20.02.2023 г.

Всем крысам 2–5 групп манипуляции проводились под общей анестезией при помощи изофлуранового наркоза (6 %) в эксикаторе. После чего крысы проверялись на стандартные защитные рефлексы. Затем уменьшалась подача наркоза в испарителе до 0.6–1 %. После чего животные помещались на операционном столе и им надевали наркозную маску. После окончания процедур выключали испаритель и снимали наркозную маску.

Забор тканей и иимуногистохимическая окраска препаратов

Эвтаназию крысам 2–5 групп проводили через 30, 90 и 180 дней после проведения эксперимента при помощи внутрибрюшинного введения токсичных доз раствора Золетила 100. После этого проводилась вырезка тканей в области холки. Ткани после проведения их забора помещались в 10 % раствор забуференного формалина и фиксировались в течение 1 недели. Проводилась заливка тканей парафином и приготовление парафиновых блоков. Толщина всех срезов составляла 4 микрона. Срезы окрашивались моноклональными кроличьими антителами к белку Ki‑67 (клон GM0010, Россия). Оценивали площадь сальных желез (ПСЖ) и долю Ki‑67‑позитивных клеток в них. Препараты сканировались на микроскопе KFBIO 400 (Konfoong Biotech International Co., Ltd., КНР). Сканированные срезы анализировались при помощи программного обеспечения Aperio ImageScope v12.2.2.5015 (Leica Microsystems, Франция).

Рис. 1. Локализация места забора аутотрансплантата жировой ткани у крыс (а), определение координат для трансплантации жировой ткани у крыс в 3–5 группах (б). Стрелкой указано место трансплантации
Fig. 1. Localization of the site of autotransplantation of adipose tissue in rats (a), determination of coordinates for transplantation of adipose tissue in rats in 3–5 groups (б). The arrow indicates the place of transplantation

Статистическая обработка данных

Данные обрабатывались в программном обеспечении Microsoft Exel, MATLAB, STATISTICA 12.6, JASP 0.14.0.0. При сопоставлении данных группы на различных сроках после введения препаратов применялся критерий Вилкоксона. При сравнении данных экспериментальных групп между собой и с данными контрольных групп применяли Краскела–­Уоллиса или критерий Манна–Уитни. Для каждого сравнения в результате статистического анализа определялся свой уровень значимости (р  <  от 0,001 до 0,05).

Результаты и обсуждение

Критерий Краскела–­Уоллиса показал, что толщина имплантированного солидного жирового графта на всех сроках в 3‑й группе была значимо выше, чем толщина подкожной жировой клетчатки (ПЖК) в той же группе и жировой ткани после аутотрансплантации мелких графтов (4‑я группа) и введения гомогенизированного жира (5‑я группа) (p < 0,001). При этом его размеры значимо не менялись в течение всего срока анализа.

Критерий Манна–Уитни показал, что через 1 месяц после проведения эксперимента в 5‑й группе подкожно-­жировая клетчатка в реципиентной области была достоверно толще по сравнению
с 3‑й и 4‑й группами (p < 0,001). Через 3 месяца размер ПЖК был значимо выше в 4‑й группе по сравнению с остальными экспериментальными группами (p < 0,01). Через полгода сохранялась та же тенденция — толщина жировой ткани в гиподерме была выше в 4‑й группе по сравнению с 3‑й (p < 0,05) и 5‑й группами (p < 0,001) (рис. 2, табл. 1).

Критерий Манна–­Уитни выявил, что в группе крыс, которым имплантировали солидный графт, толщина образовавшейся ПЖК на 90‑й день увеличилась по сравнению с 30‑м днем (p < 0,05). На 180‑й день она также выросла по сравнению с 90‑м днем (p < 0,001). В 4‑й группе толщина жира в гиподерме значимо возросла на 90‑й день по сравнению с 30‑м (p < 0,001) и на 180‑й день, по сравнению с 90‑м днем (p < 0,001) (p < 0,001) (p < 0,001) (p < 0,001) (p < 0,01). Увеличение толщины ПЖК в месте введения гомогенизированного жирового графта произошло лишь на 180‑й день после проведения эксперимента (p < 0,05) (Рисунок 2, Таблица 1).

Рис. 2. Изменения толщины жировых графтов после различных видов липофилинга
Примечание: * — различия между сроками в экспериментальных группах (p < 0,001); † — различия между сроками в экспериментальных группах (p < 0,01); ‡ — различия между сроками в экспериментальных группах (p < 0,05);  — различия между экспериментальными группами на разных сроках (p < 0,001);  — различия между экспериментальными группами на разных сроках (p < 0,01); ◊ — различия между экспериментальными группами на разных сроках (p < 0,05).
Fig. 2. Changes in the thickness of fat grafts after various types of lipofilling.
 Note: * — differences between the dates in the experimental groups (p < 0.001); † — differences between the dates in the experimental groups (p < 0.01); ‡ — differences between the dates in the experimental groups (p < 0.05);  — differences between the experimental groups at different dates (p < 0.001);  — differences between experimental groups at different dates (p < 0.01); ◊ — differences between experimental groups at different dates (p < 0.05).

Таблица 1
Значения толщины жировых графтов и ПЖК после трансплантации различных видов липофилинга

Толщина графта (мкм)		3 группа (графт)	3 группа (ПЖК)	4 группа	5 группа
30 дней	25 % перцентиль	357	45	25	31
	Медиана	1247	127	143	217
	75 % перцентиль	271	38	29	23
90 дней	25 % перцентиль	264	55	42	41
	Медиана	1184	204	295	234
	75 % перцентиль	356	51	39	47
180 дней	25 % перцентиль	233	38	38	26
	Медиана	1023	318	379	298
	75 % перцентиль	472	36	16	24

Table 1
Values of the thickness of fat grafts and subcutaneous fat tissue after transplantation of various types of lipofilling

Graft thickness (μm)		Group 3 (fat graft)	Group 3(SCF)	Group 4	Group 5
30 days	25% percentile	357	45	25	31
	median	1247	127	143	217
	75% percentile	271	38	29	23
90 days	25% percentile	264	55	42	41
	median	1184	204	295	234
	75% percentile	356	51	39	47
180 days	25% percentile	233	38	38	26
	median	1023	318	379	298
	75% percentile	472	36	16	24

Количество Ki‑67‑позитивных клеток в жировой ткани. Критерий Краскела–­Уоллиса показал, что на 30‑й день после операции в солидном графе 3‑й группы количество Ki‑67‑позитивных клеток статистически значимо было выше, по сравнению с 90‑м днем (p < 0,001). Это количество значимо уменьшилось на 180‑й день по сравнению
с 90‑м днем (p < 0,001). Количество Ki‑67‑позитивных клеток в ПЖК 3‑й группы по сравнению с 30‑м послеоперационным днем на 90‑й и 180‑й дни достоверно снизилось (p < 0,001). Этот показатель снижался и в 4‑й группе. Так, на 90‑й день Ki‑67‑позитивных клеток было меньше, чем на 30‑й день (p < 0,001), а на 180‑й день эта величина снизилась по сравнению с 90‑м днем (p < 0,01). Количество Ki‑67‑позитивных клеток в жировой ткани в месте введения гомогенизированного жира на 90‑й день было значимо меньше, чем на 30‑й день (p < 0,001). Через 6 месяцев этот показатель достоверно уменьшился по сравнению с тремя месяцами раннее (p < 0,05) (рис. 3, табл. 2). Критерий Манна–Уитни определил, что через 30 дней после операции количество Ki‑67‑позитивных клеток в жировом графте 3‑й группы было значимо выше, чем в ПЖК реципиентного места 3‑й группы и 5‑й группы (p < 0,001). Данный показатель был значимо выше в 4‑й группе по сравнению с ПЖК в месте аутотрансплантации жира 3‑й группы (p < 0,001) и 5‑й группы (p < 0,001) и ниже, по сравнению с солидным графтом 3‑й группы (p < 0,05). Количество Ki‑67‑позитивных клеток было достоверно выше в 5‑й группе по сравнению
с ПЖК 3‑й группы (p < 0,01) (рис. 3, табл. 2). Согласно критерию Манна–­Уитни, на 90‑й день после проведения операции количество Ki‑67‑позитивных клеток в солидном графе 3‑й группы было значимо выше, чем в ПЖК реципиентного места той же группы и 5‑й группы (p < 0,001), а также 4‑й группы (p < 0,01). В 4‑й группе в ПЖК в месте введения жировых аутотрансплантатов количество Ki‑67‑позитивных клеток было значимо выше, чем в ПЖК 3‑й группы (p < 0,001) и 5‑й группы (p < 0,01). В группе гомогенизированного жира этот показатель был статистически выше, чем в подкожно-­жировой клетчатке в области места аутотрансплантации солидного графта в 3‑й группе (p < 0,05). Через 180 дней количество Ki‑67‑позитивных клеток было достоверно выше лишь в солидном графте 3‑й группы по сравнению с ПЖК той же группы и остальных экспериментальных групп (p < 0,001) (рис. 3, табл. 2).

Рис. 3. Изменения содержания Ki‑67‑позитивных клеток в жировой ткани после различных видов липофилинга (описание в тексте)
Примечание: * — различия между сроками в экспериментальных группах (p < 0,001); † — различия между сроками в экспериментальных группах (p < 0,01); ‡ — различия между сроками в экспериментальных группах (p < 0,05);  — различия между экспериментальными группами на разных сроках (p < 0,001);  — различия между экспериментальными группами на разных сроках (p < 0,01); ◊ — различия между экспериментальными группами на разных сроках (p < 0,05).
Fig. 3. Changes in the content of Ki‑67‑positive cells in adipose tissue after various types of lipofilling (description in the text)
Note: * — differences between the dates in the experimental groups (p < 0.001); † — differences between the dates in the experimental groups (p < 0.01); ‡ — differences between the dates in the experimental groups (p < 0.05);  — differences between the experimental groups at different dates (p < 0.001);  — differences between experimental groups at different dates (p < 0.01); ◊ — differences between experimental groups at different dates (p < 0.05).

Таблица 2
Значения количества Ki‑67‑позитивных клеток после трансплантации различных видов жировых графтов

Ki‑67‑позитивные клетки (n/500000 µm2)		3 группа (графт)	3 группа (ПЖК)	4 группа	5 группа
30 дней	25 % перцентиль	5,67	2,33	3,53	4,78
	Медиана	75,61	11,18	62,37	25,64
	75 % перцентиль	6,33	2,27	5,09	3,49
90 дней	25 % перцентиль	2,08	0,17	2,64	1,24
	Медиана	21,33	1,26	13,55	8,57
	75 % перцентиль	1,72	0,13	3,41	1,01
180 дней	25 % перцентиль	1,07	0,21	1,01	0,67
	Медиана	4,97	1,08	3,67	3,95
	75 % перцентиль	1,34	0,09	0,99	0,44

Table 2
Values of the number of Ki‑67‑positive cells after transplantation of various types of fat grafts

Ki‑67‑positive cells (n/500000 µm2)		Group 3(fat graft)	Group 3(SCF)	Group 4	Group 5
30 days	25% percentile	5.67	2.33	3.53	4.78
	median	75.61	11.18	62.37	25.64
	75% percentile	6.33	2.27	5.09	3.49
90 days	25% percentile	2.08	0.17	2.64	1.24
	median	21.33	1.26	13.55	8.57
	75% percentile	1.72	0.13	3.41	1.01
180 days	25% percentile	1.07	0.21	1.01	0.67
	median	4.97	1.08	3.67	3.95
	75% percentile	1.34	0.09	0.99	0.44

Данное исследование является первым, в котором описана экспрессия белка Ki‑67 в жировых графтах в зависимости от вида обработки пересаженного аутожира у крыс.

Обогащение жирового графта культивированными клетками СВФ и тромбоцитарным фактором роста представляет собой один из перспективных методов, активно исследуемых для улучшения выживаемости трансплантатов. Эти подходы могут способствовать выживанию трансплантата через несколько механизмов, включая усиление ангиогенеза, что, в свою очередь, улучшает кровоснабжение и доставку кислорода и питательных веществ к клеткам трансплантата. Кроме того, разбиение жирового трансплантата на более мелкие фрагменты также может способствовать улучшению выживаемости. Такой подход обеспечивает более эффективный доступ привитых клеток к оксигенации и питанию в донорской области. Уменьшая размер фрагментов, можно увеличить площадь поверхности, что позволяет улучшить диффузию кислорода и питательных веществ, а также способствует более равномерному распределению клеток в трансплантате. Таким образом, сочетание этих методов может создать оптимальные условия для выживания и интеграции жирового трансплантата, что имеет важное значение для успешного выполнения процедур пересадки жировой ткани в клинической практике [7]. В настоящем исследовании именно группа крыс, которой были пересажены мелкие жировые графты, показала самую высокую экспрессию Ki‑67 в графте через 1 и 3 месяца по сравнению с другими группами. Эти показатели схожи и с ростом толщины жира в гиподерме. Это связано, по-видимому, с тем, что солидный графт подвергается некрозу на ранних стадиях его приживаемости и с последующим его фиброзированием, а при пересадке гомогенизированного жира, вероятно, погибает достаточное количество стволовых клеток из стромально-­васкулярной фракции [8]. Рост экспрессии белка Ki‑67 в солидном графте, по сравнению с другими группами, по нашему мнению, свидетельствует о запуске процессов регенерации и фиброза, так как количество Ki-позитивных клеток было высоко в соединительной ткани [9], а не в жировой.

У интактных крыс и крыс, которым вводили 0,9 % раствор хлорида натрия, в гиподерме жировой ткани обнаружено не было. В связи с этим представляется интересным тот факт, что после трансплантации солидного графта между гиподермой и мышечным слоем в гиподерме у крыс была обнаружена новая жировая ткань. Это, скорее всего, связано с миграцией клеток стромально-­васкулярной фракции из поверхностных слоев графта в соседние слои гиподермы или воздействием факторов дифференцировки из трансплантированных клеток на стволовые клетки мезенхимы в реципиентном месте. Это подтверждается исследованиями, в которых меченые стволовые клетки жировой ткани мышам вводили внутривенного после пересадки жировых графтов, в которых эти клетки активно накапливались [10]. В других исследованиях, направленных на изучение стволовых клеток жировой ткани в процессах ревитализации послеоперационных тканей, была подтверждена способность СТКЖ к миграции в области послеоперационной раны [11]. Тем не менее, толщина этого новообразованного жира с течением времени (на 90‑й и 180‑й дни) стала уменьшаться, что связано, по-видимому, со снижением активности клеток СВФ, которые в условиях гипоксии могут сохранять свою активность до 3 недель и запускать процессы регенерации уже через 3 дня после проведения липофилинга [12]. Подобные изменения новообразованной жировой клетчатки у крыс помогут объяснить исследования, направленные на изучение апоптоза после аутотрансплантации жира [13–19]. В клинической практике понимание этих механизмов поможет найти методику сохранения объемов имплантированного и новообразованного жира.

Выводы

На основании полученных результатов очевидно, что трансплантация солидного графта через 3 месяца провоцирует стимуляцию образования подкожно-­жировой клетчатки в месте его введения, с высокой активностью экспрессии белка Ki‑67 клетками в самом жировом графте. При аутотрансплантации жировых графтов мелкого размера (1х2х1 мм) и гомогенизированного жира через 30 и 90 дней отмечается прорастание соединительно-­тканных тяжей, содержащих Ki‑67‑позитивные клетки и кровеносные сосуды. Различный размер адипоцитов при данных методах трансплантации косвенно свидетельствует о разных стадиях их роста и дифференцировки.

Размер жирового графта напрямую оказывает влияние на экспрессию белка Ki‑67 в клетках аутотрансплантатов. Введение гомогенизированного жира провоцирует наименьшую активность экспрессии белка Ki‑67 на всех сроках по сравнению с солидным и измельченными жировыми графтами.

About the authors

Svetlana S. Ibadullaeva

Clinic Be Healthy; Aesthetic centre Referans

Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9237-3995
Moscow, Russian Federation; Baku, Azerbaijan

Igor V. Kastyro

Clinic Be Healthy

Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6134-3080
SPIN-code: 5694-3710
Moscow, Russian Federation

Yulia E. Dyachenko

Clinic Be Healthy

Author for correspondence.
Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8469-6073
SPIN-code: 8345-5829
Moscow, Russian Federation

Elina A. Lavrentyeva

Clinic Be Healthy

Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0005-3833-1491
Moscow, Russian Federation

Maxim V. Khlystalov

Clinic Be Healthy

Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-6766-8323
Moscow, Russian Federation

Svetlana E. Moroz

Clinic Be Healthy

Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3892-0596
Moscow, Russian Federation

Igor B. Ganshin

Clinic Be Healthy

Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5766-9416
SPIN-code: 2765-7044
Moscow, Russian Federation

Valentin I. Popadyuk

Clinic Be Healthy

Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3309-4683
SPIN-code: 6284-8040
Moscow, Russian Federation

Alla F. Kartasheva

Clinic Be Healthy

Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8533-301X
SPIN-code: 5814-9282
Moscow, Russian Federation

Alexey G. Korolev

M.V. Lomonosov Moscow State University

Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0828-7715
SPIN-code: 5114-8832
Moscow, Russian Federation

Mikhail I. Barannik

Clinic Be Healthy

Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6540-3252
SPIN-code: 8925-3202
Moscow, Russian Federation

Pavel V. Sarygin

Clinic Be Healthy

Email: julika-98@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3787-2147
SPIN-code: 4926-4406
Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files