Изучение механизма действия новых производных хиноксалин 1,4-диоксида на модельном объекте Mycobacterium smegmatis

Полный текст

Введение Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) по-прежнему остается одной из основных угроз современной медицины - c 2018 по 2021 г. произошло 649 000 новых случаев туберкулеза с устойчивостью к рифампицину (RR-TB) - самому эффективному препарату первой линии, из которых в 78 % случаев возникла МЛУ (устойчивость к рифампицину и изониазиду) [1]. Возникновение штаммов с МЛУ может в том числе являться следствием недостаточной приверженности курсу лечения пациентов, прерванной терапии или неправильно подобранного курса химиотерапии. Россия, наряду с Индией и Китаем, входит в число стран с наибольшим распространением МЛУ-туберкулеза (WHO Global Tuberculosis Report 2022). Наибольшую опасность среди штаммов c МЛУ представляют штаммы ТБ с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ), устойчивые к 4-9 препаратам [2]. Увеличение уровня устойчивости также связывают с накоплением антибиотиков в природе и активацией систем природной лекарственной устойчивости у бактерий. По последним данным, одним из факторов, ускоряющим возникновение ЛУ, является наличие в окружающей среде минимальных селективных концентраций (minimal selective concentrations, MSC) антибиотиков, которые могут приводить к увеличению устойчивых штаммов в популяции и активации механизмов защиты клетки от антибиотиков (выброс или инактивация антибиотиков) [3-5]. Таким образом, одной из основных сегодняшних задач является поиск новых противотуберкулезных препаратов (ПТП), которые будут обладать принципиально новыми механизмами действия, что позволит преодолеть феномен лекарственной устойчивости. Целью данного исследования являлось изучение механизма действия перспективных кандидатов в ПТП - нового производного хиноксалин 1,4-диоксида, синтезированного нами ранее 4 [6]. Данные соединения были отобраны благодаря высокой активности в отношении микобактерий - показано, что соединения данного класса вносят однои двухнитевые разрывы в ДНК, приводя к гибели клеток, что делает их перспективными для дальнейшего изучения и модификации [7]. Методами обратной генетики мы показали, что мутации в генах MSMEG_4646, MSMEG_5122 и MSMEG_1380 обеспечивают устойчивость к соединению 4 [6]. В данной работе с использованием генетических конструкций с повышенным уровнем экспрессии генов мы изучили механизмы перекрестной устойчивости к производным хиноксалин 1,4-диоксида на модельном объекте Mycobacterium smegmatis. Материалы и методы Штаммы бактерий и условия инкубации Клетки штаммов Mycolicibacterium (Mycobacterium) smegmatis (табл. 1). выращивали в жидкой среде Middlebrook 7H9 (Himedia) с добавлением OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза, каталаза), 0,05 % Tween 80, 0,4 % глицерина и в жидкой среде Lemco-Tween. Состав среды Lemco-Tween (на 1 литр): 5 г пептона (Oxoid), 5 г Lab Lemco (Oxoid), 5 г NaCl, 0,05 % Tween 80. Для выращивания M. smegmatis на агаризованной среде использовалась среда М290 (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd). M. smegmatis инкубировали при t = 37 °С. Таблица 1. Бактериальные штаммы, использованные в этой работе Бактериальные штаммы Название Описание Ссылка M.smegmatis mc2 155 Штамм дикого типа (w.t.) [8] M. smegmatis qdr Спонтанные мутанты M. smegmatis qdR1, qdR4 и qdR5, устойчивые к соединению 1 [9] M. smegmatis Штаммы M. smegmatis, несущие pMind, содержащую мутантные гены: pM4646w, pM4646q314, pM4648w, pM4648q1, pM5122 Настоящая работа Источник: составлено авторами. Клонирование генов, содержащих мутации в генах MSMEG_4646, MSMEG_4648, MSMEG_5122 в плазмидный вектор pMind Гены MSMEG_4646, MSMEG_4648, MSMEG_5122 M. smegmatis были амплифицированы с геномной ДНК мутантных штаммов, устойчивых к производному хиноксалин 1,4-диоксида - 4, и штамма WT M. smegmatis mc2 155 по праймерам, подобранным с помощью primer BLAST NCBI (табл. 2). Оптимальная температура отжига праймеров была подобрана с помощью градиентной ПЦР на приборе Bio-Rad T100 (США). Для амплификации использовали набор Tersus Plus PCR kit (Евроген). Амплифицированный фрагмент был клонирован в челночный репликативный вектор pMind по сайтам рестрикции NdeI и SpeI (Fast digest, Thermo Scientific, США). Для лигирования использовали Т4-ДНК лигазу (Thermo Scientific, США). Полученными конструкциями трансформировали компетентные клетки E. coli по стандартной методике [10]. Оценка наличия целевой вставки нужной длины проводилась методом ПЦР-скрининга колоний. Из клеток E. coli конструкции со вставками целевых генов выделяли с помощью набора для выделения плазмидной ДНК (Евроген, Россия). Полученные конструкции были трансформированы в компетентные клетки M. smegmatis mc2 155 методом электропорации по методике [11]. Таблица 2. Праймеры, использованные в работе Название праймера Праймеры для клонирования в pMind pM_4646_f NdeI 5′ ttttCATATGggaggaaatgttATGGGTGACAACGGCAACGG 3′ pM_4646_r SpeI 5′ ttttACTAGTTCATGCGTTCGCTCCCACAG 3′ pM_4648_f NdeI 5′ ttttCATATGggaggaaatgttATGGCGCACCGGTACAAGG 3′ pM_4648_r SpeI 5′ ttttACTAGTTCACATCGGCAGGTTGTAGGG 3′ pM_5122_f NdeI 5′ ttttCATATGggaggaaatgttATGACGTACGTCATTGCCGAAC 3′ pM_5122_r SpeI 5′ ttttACTAGTTCAGTCCTCACCCTGAGGC 3′ Источник: составлено авторами. Тест на чувствительность M. smegmatis к производным хиноксалин 1,4-диоксида Культуры инкубировали при 200 об./мин и 37 °C в течение ночи до OD 600 = 1,2. Затем определяли чувствительность к производным хиноксалин 1,4-диоксида методом бумажных дисков (диффузно-дисковым методом): культуру M. smegmatis разводили 1 : 9 : 10 (культура : вода : среда М290 (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd)) и высевали поверх основного слоя агара на чашки Петри. Чашки Петри инкубировали в течение 2 дней при 37 °C до полного роста бактериального газона. Ореолы ингибирования роста измеряли с точностью до 1 мм. Опыты проводили троекратно; рассчитывали средний диаметр и стандартное отклонение (СО). Критерием отбора положительных результатов было наличие достоверной разницы в величине диаметра зоны ингибирования роста и отсутствие пересечения стандартных отклонений диаметров зон ингибирования роста экспериментального и контрольного образцов M. smegmatis [12]. Результаты Исследование перекрестной устойчивости мутантов M. smegmatis qdR. Для исследования перекрестной устойчивости к производным хиноксалин 1,4-диоксида нами были использованы спонтанные мутанты M. smegmatis mc2 155, устойчивые к 4-кратному МИК соединения 4 (табл. 3), полученные и частично охарактеризованные ранее [6]. С помощью сравнительного геномного анализа были выявлены мутации в четырех различных генах: MSMEG_1380, MSMEG_4646, MSMEG_4648, а также в гене и его промоторной области MSMEG_5122. Методами обратной генетики было показано, что мутации в генах MSMEG_1380, MSMEG_4648 и MSMEG_5122 приводят к устойчивости к описанным ранее производным хиноксалина 1,4-диоксида [6]. Для исследования перекрестной устойчивости к производным хиноксалин 1,4-диоксида, а следовательно, понимания наличия общности механизма действия или устойчивости M. smegmatis к различным хиноксалин 1,4-диоксидам были использованы спонтанные мутанты M. smegmatis, устойчивые к соединению 4: M. smegmatis qdR1, M. smegmatis qdR4 и M. smegmatis qdR5 (см. табл. 2). Возможную перекрестную устойчивость проверяли к следующим соединениям: 4, 13c, 12c, 13a, 16c, 14a, 15c (соединения, представлены в табл. 3). Таблица 3. Химические соединения, использованные в исследовании № Название Ссылка 4 2-карбоэтокси-3-метил-6-(пиперазин-1-ил)-7-хлорхиноксалин 1,4-диоксида гидрохлорид [6] 13c 2-ацетил-7-(пиперазин-1-ил)-3-трифторметил-6-хлорхиноксалин 1,4-диоксида гидрохлорид [9] 12c 7-(пиперазин-1-ил)-3-трифторметил-6-хлор-2-этоксикарбонилхиноксалин 1,4-диоксида гидрохлорид 13a 2-ацетил-7-(пиперазин-1-ил)-3-трифторметилхиноксалин 1,4-диоксида гидрохлорид 16c 7-(пиперазин-1-ил)-3-трифторметил-2-фураноил-6-хлорхиноксалин 1,4-диоксида гидрохлорид 14a 7-(пиперазин-1-ил)-2-пропаноил-3-трифторметилхиноксалин 1,4-диоксида гидрохлорид 15c 2-бензоил-7-(пиперазин-1-ил)-3-трифторметил-6-хлорхиноксалин 1,4-диоксида гидрохлорид Источник: составлено авторами. Исследование выявило перекрестную устойчивость ко всем испытанным соединениям практически во всех случаях. Мутанты серии qdR были устойчивы к большинству проанализированных производных хиноксалин 1,4-диоксидов (рис. 1). Штамм M. smegmatis qdR1 в целом был чувствительнее остальных мутантов, хотя и достоверно устойчивее штамма дикого типа ко всем соединениям. Рис. 1. Диаметры зон ингибирования роста вокруг дисков, содержащих различные хиноксалин 1,4-диоксиды, в отношении спонтанных мутантов M. smegmatis, устойчивых к соединению 4. Концентрация соединений - 10 нмоль/диск. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение Источник: составлено авторами. Исследование роли отдельных генов и мутаций в формировании устойчивости к хиноксалин 1,4-диоксидам Ранее проведенное полногеномное секвенирование показало, что мутанты M. smegmatis, qdR1, M. smegmatis, qdR4 и M. smegmatis, qdR5 имеют уникальные несинонимичные мутации [6], что подтверждает предыдущие сообщения о ДНК-повреждающих свойствах хиноксалин 1,4-диоксидов [7]. Количество уникальных мутаций в каждом штамме коррелировало с уровнем устойчивости, что позволяет предположить, что их комбинация имеет синергический эффект. Мы проанализировали возможную связь всех мутантных генов и выделили несколько генов, связанных с окислением пирувата до ацетил-КоА. Таблица 4. Уникальные мутации в геномах мутантов M. smegmatis qdr1, M. smegmatis qdr4 и M. smegmatis qdr5 Protein ID Locus tag Annotation Codon SNP A.a. Distance to gene M. smegmatis qdr1 YP_888911.1 MSMEG_4648 DNA-binding protein 49 CAG > CCG Q > P - YP_889369.1 MSMEG_5122 Ferredoxin - - - 71-72 M. smegmatis qdR4 YP_888909.1 MSMEG_4646 Pyruvate synthase 95 AAC > CAC N > H - M. smegmatis qdR5 YP_888909.1 MSMEG_4646 Pyruvate synthase 274 CCG > CTG P > L - Источник: составлено авторами. Сверхэкспрессия целевых генов дикого типа и их мутантных вариантов у M. smegmatis Для исследования роли отдельных генов и мутаций в них в формировании устойчивости к хиноксалин 1,4-диоксидам нами использован подход - сверхэкспрессия целевых генов дикого типа и их мутантных вариантов (табл. 4). Для этого подхода нами использован вектор pMIND [13], имеющий ориджины для репликации в клетках E. coli и микобактерий, а также индуцибельный тетрациклиновый промотор. Нами были получены следующие конструкции: • pM4646wt: pMIND, содержащая ген MSMEG_4646 дикого типа; • pM4646qdr4: pMIND, содержащая ген MSMEG_4646 с мутацией AAC > CAC в кодоне 95 (N → H), соответствующая мутанту M. smegmatis qdR4; • pM4646qdr5: pMIND, содержащая ген MSMEG_4646 с мутацией CCG > CTG в кодоне 274 (P → L), соответствующая мутанту M. smegmatis qdR5; • pM4648wt: pMIND, содержащая ген MSMEG_4648 дикого типа; • pM4648qdr1: pMIND, содержащая ген MSMEG_4648 с мутацией CAG > CCG в кодоне 274 (Q → P), соответствующая мутанту M. smegmatis qdR1; • pM5122: pMIND, содержащая ген MSMEG_5122 дикого типа. Данными конструкциями был трансформирован штамм M. smegmatis mc2 155. Фенотип лекарственной чувствительности полученных трансформантов M. smegmatis, несущих сконструированные плазмиды, оценивался диско-диффузным методом, в качестве соединения-контроля использовался рифампицин (rif) (рис. 2). Рис. 2. Диаметры зон ингибирования роста вокруг дисков, содержащих различные хиноксалин 1,4-диоксиды, на культурах M. smegmatis. Концентрация соединений - 10 нмоль/диск. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение Источник: составлено авторами. Результаты (рис. 2) показали достоверное повышение устойчивости к соединениям 4, 12c, 14a и 13c при сверхэкспрессии мутантных генов MSMEG_4646. Сверхэкспрессия мутантных генов MSMEG_4648 не приводила к повышению устойчивости. Сверхэкспрессия гена дикого типа MSMEG_5122 закономерно приводила к повышению чувствительности к соединениям 4 и 12c, вероятно, смещая равновесие окислительно-восстановительной реакции за счет присутствия большего количества донора электронов. Выводы В результате проведенной работы нам удалось установить предполагаемый механизм действия производных хиноксалин 1,4-диоксида на модельном объекте Mycobacterium smegmatis. Можно предположить, что различия в уровне чувствительности мутантных штаммов основаны на различных наборах мутаций у разных штаммов. Так, у мутантов, qdR4 и qdR5 есть мутации в гене MSMEG_4646 (см. табл. 4), кодирующем альфа-субъединицу ферредоксин-оксидоредуктазы (пируват-синтазы), участвующей в метаболизме пирувата. У мутанта qdR1 обнаружена мутация в гене MSMEG_4648, аннотированным как ДНК-связывающий белок, который может выступать регулятором транскрипции находящегося рядом оперона, кодирующего альфаи бета-субъединицы вышеуказанной пируват-синтазы и MSMEG_5122. У одного из исследуемых ранее мутантов мы смогли обнаружить мутацию только в гене MSMEG_5122, кодирующем непосредственно ферредоксин, а мутант qdR1 также имеет две мутации в предположительной промоторной области гена MSMEG_5122 (позиции - 71-72), при этом оба мутантных штамма были устойчивы к исследуемому соединению. Ферредоксин выступает акцептором электронов для пируват-синтазы в процессе окисления пирувата до ацетил-КоА. Вероятно, мутантная субъединица конкурирует с таковой дикого типа при формировании комплекса пируват-синтазы, что в сумме снижает эффективность его работы и активации хиноксалин 1,4-диоксидов, приводя к снижению чувствительности штамма к исследуемому соединению.

Об авторах

Алексей Александрович Ватлин

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук; Российский университет дружбы народов

Автор, ответственный за переписку.
Email: vatlin_alexey123@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6673-7633

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории генетики микроорганизмов

Российская Федерация, 119333, г. Москва, ул. Губкина, д. 3

Светлана Григорьевна Фролова

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Email: sveta.frolova.1997@bk.ru
младший научный сотрудник лаборатории генетики микроорганизмов Российская Федерация, 119333, г. Москва, ул. Губкина, д. 3

Ольга Борисовна Беккер

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Email: obbekker@mail.ru
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории генетики микроорганизмов Российская Федерация, 119333, г. Москва, ул. Губкина, д. 3

Валерий Николаевич Даниленко

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Email: valerid@vigg.ru
доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией генетики микроорганизмов Российская Федерация, 119333, г. Москва, ул. Губкина, д. 3

Список литературы