СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ РАЗНЫХ ТЕСТ-ФУНКЦИЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE К СОЛЯМ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

Полный текст

Введение Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами возрастает. Тяжелые металлы могут нарушать и биотический круговорот веществ, и представлять опасность для здоровья человека [1-4]. Для оценки токсичности солей тяжелых металлов широко используют различные эукариотические микроорганизмы [5]. Особенно перспективным объектом для биотестирования служат дрожжи S. cerevisiae, которые являются одноклеточными микроорганизмами, обладающими высокой скоростью роста. В то же время, у дрожжей, как у эукариотических организмов, высокая степень гомологии клеточной организации и обмена веществ с высшими эукариотами [6]. Применяют дрожжи и для биотестирования тяжелых металлов. Большинство биотестов основаны на определении цитотоксического и генотоксического эффектов, на подавлении метаболической активности дрожжей [7-10]. Эти приемы биотестирования достаточно трудоемки, требуют специального оборудования и особых условий. Известен биотест с использованием сухих дрожжей S. cerevisiae, в котором в качестве тест-отклика используется изменение удельной электропроводности суспензии дрожжей, возникающей в результате ингибирования процессов ферментации в присутствии токсикантов, в том числе, солей тяжелых металлов [11]. Ранее авторы предлагали применять тест-реакцию, основанную на способности пекарских дрожжей S. cerevisiae, как дрожжей верхового брожения, образовывать пену на поверхности сбраживаемой жидкости [12]. Данная работа была предпринята для того, чтобы сравнить чувствительность разных тест-функций дрожжей S. cerevisiae при тестировании солей тяжелых металлов. Материалы и методы В качестве тест-объекта использовали препарат сухих пекарских дрожжей «Саф-Момент» (ООО «Саф-Нева», Россия) и культуру S. cerevisiae, выделенную авторами из этого препарата. Для проведения исследований брали следующие соли тяжелых металлов (хч): HgCl 2 , CdCl 2 , CoCl 2 , CuSO 4 , Pb(CH 3 COO), Fe 2 (SO 4 ) 3 , ZnSO 4 . При оценке токсичности исследуемых солей тяжелых металлов определяли их влияние на рост S. cerevisiae. Для культивирования дрожжей использовали среду YEPD следующего состава (г/л): глюкоза - 20,0; пептон - 10,04 дрожжевой автолизат - 5,0. В колбах объемом 250 мл готовили по 50 мл жидкой среды YEPD и добавляли в нее соли тяжелых металлов так, чтобы их конечная концентрация в среде составляла: 0,0001; 0,001; 0,01; 1,0 и 10,0 г/л. В качестве контроля брали среду YEPD без добавления солей тяжелых металлов. Среды засевали суспензией S. cerevisiaeв количестве 1% (от общего объема) и инкубировали в стационарных условиях при температуре +30 °С. Количество жизнеспособных клеток дрожжей в средах определяли через 24 ч. Влияние солей тяжелых металлов на выживаемость дрожжей оценивали после 3-часового экспонирования дрожжевых суспензий с добавлением 0,0001-10 г/л тестируемых токсикантов [13]. Количественный учет жизнеспособных клеток дрожжей осуществляли по методу Коха. При исследовании действия солей тяжелых металлов на длительность lag-фазы S. cerevisiae измеряли оптическую плотность культуральной жидкости через каждые 30 мин в течение 12 ч. Воздействие исследуемых солей тяжелых металлов на пенообразующую активность S. cerevisiae определяли по авторскому экспресс приему [12]. Для этого в 20 мл раствора исследуемой соли тяжелого металла вносили 1,36 г сухих дрожжей, тщательно перемешивали и добавляли 0,4 г глюкозы. Приготовленную реакционную смесь разливали по 3 мл в мерные пробирки объемом 10 мл каждая, инкубировали в течение 15 мин при температуре +20°С, затем определяли объем образовавшейся пены. Контролем служила суспензия дрожжей с глюкозой без внесения солей тяжелых металлов. Все эксперименты проводили не менее чем в 5 независимых опытах с 3-6 параллельными измерениями в каждом. Для статистической обработки полученных данных использовали пакет программ Microsoft Excel. Выводы сделаны с вероятностью безошибочного прогноза Р - 0,95. Достоверность различия результатов определяли с помощью критерия Стьюдента. Результаты и их обсуждение Изучение влияния солей тяжелых металлов на течение лаг-фазы S. cerevisiae показало следующее. В присутствии 0,01 г/л хлорида кадмия ее длительность увеличивалась на 3 ч, 0,1 г/л хлорида кобальта - на 4 ч, 1 г/л сульфата цинка - на 2 ч по сравнению с контролем. Хлорид ртути при содержании 0,0001-0,01 г/л, сульфат цинка - 0,0001-0,1 г/л не оказывали влияния на продолжительность лаг-фазы. Повышение концентрации хлорида ртути до 0,1 г/л, асульфата меди до 1 г/л приводило к подавлению роста культуры. Сульфат железа при содержании 0,0001-1,0 г/л не влиял на длительность лаг-фазы (рис. 1). При определении количества жизнеспособных клеток дрожжей после 24-часового культивирования в средах YEPD с добавлением солей тяжелых металлов получили следующее. Хлорид ртути и сульфат меди начинали подавлять рост при содержании 0,001 г/л, сульфат железа - 0,01 г/л, хлорид кадмия и хлорид кобальта - 0,1 г/л (рис. 2). Следует отметить, что в присутствии 0,0001 г/л сульфата железа и хлорида кобальта отмечали незначительное стимулирующее воздействие на рост S. cerevisiae. Ацетат свинца в диапазоне концентраций до 1 г/л не подавлял роста культуры дрожжей, при содержании 0,0001; 0,001 и 0,01 г/л стимулировал их рост (см. рис. 2). После 3-часового экспонирования дрожжей в растворах тестируемых солей тяжелых металлов достоверное снижение количества жизнеспособных клеток отмечали в присутствии 0,01 г/л хлорида ртути, 0,1 г/л сульфата медии хлорида кадмия, 1 г/л ацетата свинца и хлорида кобальта. При этом численность дрожжей была ниже, чем в контроле в 2,7; 2,2; 2,8; 9,7 и 8,8 раз, соответственно. В растворах сульфата железа с концентрацией 0,0001-10 г/л количество клеток достоверно не отличалось от контроля (рис. 3). Наиболее чувствительной к солям тяжелых металлов оказалась пенообразующая активность S. cerevisiae. Хлорид ртути подавлял пенообразование в дрожжевой суспензии в концентрации 0,0001 г/л, при этом объем образовавшейся пены был на 56,3% меньше, чем в контроле (рис. 4). Сульфат меди, хлорид кадмия и хлорид кобальта оказывали токсическое действие на процесс пенообразования при содержании 0,001 г/л, снижая его интенсивность на 41,5; 25,0 и 21,0% по сравнению с контролем, соответственно (см. рис. 4). Токсический эффект ацетата свинца отмечали при содержании 0,01 г/л, сульфата железа - 0,1 г/л, сульфата цинка - 1 г/л. При этом объем пены был на 34,6; 20,7 и 25,0% меньше, чем в контроле, соответственно (см. рис. 4). Время инкубирования, ч контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0 5 10 15 20 25 контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 -2 3 8 13 контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 0 2 4 6 8 10 контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 2 4 6 8 10 контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л Оптическая плотность суспензии, о.е. Время инкубирования, ч 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 аб Оптическая плотность суспензии, о.е. Время инкубирования, ч Оптическая плотность суспензии, о.е. Время инкубирования, ч вг Оптическая плотность суспензии, о.е. Время инкубирования, ч Оптическая плотность суспензии, о.е. Время инкубирования, ч де Рис. 1. Влияние CdCl 2 (А) и HgCl 2 (B), CuSO 4 (С),CoCl 2 (D), ZnSO 4 (E) и Fe 2 (SO 4 ) 3 (F) на продолжительность лаг-фазы роста дрожжей S. cerevisiаe (Fig. 1. Effect of CdCl 2 (A) and HgCl 2 (B), CuSO 4 (C), CoCl 2 (D), ZnSO 4 (E), and Fe 2 (SO 4 ) 3 (F) on the duration of the growth phase of yeast S. cerevisiae) Концентрация соли тяжелого металла, г/л CdCl 2 HgCl 2 СоCl 2 Fe 2 (SO 4 ) 3 CuSO 4 Pb(C 2 H 3 O 2 ) 2 исходное количество клеток Рис. 2. Влияние солей тяжелых металлов на рост культуры S. cerevisiae (Fig. 2. Effect of heavy metal salts on the growth of S. cerevisiae) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CoCl 2 HgCl 2 Pb(CH 3 COO) 2 CuSO 4 CdCl 2 Fe 2 (SO 4 ) 3 контроль 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 Количество жизнеспособных клеток, 10 6 , кое/мл Концентрация соли тяжелого металла, г/л Рис. 3. Влияние солей тяжелых металлов на выживаемость S. cerevisiae (Fig. 3. Effect of heavy metal salts on the survival of S. cerevisiae) Проведенные исследования показали, что существует чувствительность к солям тяжелых металлов пенообразующей активности S. cerevisiae выше, их ростовой функции и выживаемости. По уменьшению чувствительности к используемым солям тяжелых металлов исследуемые тест-функции дрожжей располагаются в следующем порядке: пенообразующая активность > рост > выживаемость - продолжительность лаг-фазы. Вместе с этим, ряды токсичности солей тяжелых металлов во многом совпадают: - пенообразующая активность - HgCl 2 ; CuSO 4 ; CdCl 2 ; CoCl 2 ; Pb(CH 3 COO) 2 ; Fe 2 (SO 4 ) 3 ; ZnSO 4 ; - рост - HgCl 2 ; CuSO 4 ; CdCl 2 ; Fe 2 (SO 4 ) 3 ; СоCl 2 ; Pb(CH 3 COO) 2 ; - выживаемость - HgCl 2 ; CuSO 4 ; CdCl 2 ; CoCl 2 , Pb(CH 3 COO) 2 ; Fe 2 (SO 4 ) 3 ; - продолжительность лаг-фазы - CdCl 2 ; HgCl 2 ; CoCl 2 ; CuSO 4 ; ZnSO 4 ; Fe 2 (SO 4 ) 3 . Рис. 4. Влияние солей тяжелых металлов на пенообразование в суспензии дрожжей с глюкозой (Fig. 4. Effect of heavy metal salts on foaming in a suspension of yeast with glucose) Как видно из приведенных данных, повышенной токсичностью по отношению к пекарским дрожжам S. cerevisiae обладают хлорид ртути, сульфат меди, хлорид кадмия. Близкие результаты по влиянию этих солей на жизнеспособность дрожжей показаны и в работах других авторов [7; 14-18]. Биотест по определению пенообразующей активности S. cerevisiae наряду с более высокой чувствительностью отличается меньшими временными и материальными затратами. Время тест-отклика составляет 15 мин. Метод не требует специального микробиологического оборудования и питательных сред. Нет необходимости в поддержании культуры в жизнеспособном состоянии, так как для проведения тест-реакции используются коммерческие препараты сухих дрожжей. Заключение Таким образом, тест-реакция по подавлению пенообразующей активности пекарских дрожжей S. cerevisiae более чувствительна к солям тяжелых металлов по сравнению с ростовой функцией дрожжей и их выживаемостью. Она выгодно отличается технической простотой и может быть использована в качестве экспрессного биотеста для оценки токсичности сред, загрязненных поллютантами этого класса.

Об авторах

О Ф Вятчина

Иркутский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: olgairk3@rambler.ru

Вятчина Ольга Федоровна - кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры микробиологии, Биолого-почвенный факультет, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Иркутский государственный университет».

ул. Карла Маркса, 1, Иркутск, Россия, 664003

Г О Жданова

Иркутский государственный университет

Email: zhdanova86@yandex.ru

Жданова Галина Олеговна - младший научный сотрудник лаборатории водной токсикологии, Научно-исследовательский институт биологии, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Иркутский государственный университет».

ул. Карла Маркса, 1, Иркутск, Россия, 664003

Д И Стом

Иркутский государственный университет

Email: stomd@mail.ru

Стом Дэвард Иосифович - доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией водной токсикологии Научно-исследовательского института биологии, профессор кафедры зоологии позвоночных и экологии Биолого-почвенного факультета, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Иркутский государственный университет»; профессор кафедры инженерных коммуникаций и систем жизнеобеспечения Иркутского национального исследовательского технического университета; главный научный сотрудник Байкальского музея Иркутского Научного Центра Сибирского Отделения РАН.

ул. Карла Маркса, 1, Иркутск, Россия, 664003

Список литературы