ОТБОР БАКТЕРИЙ-СИМБИОНТОВ РОДА LACTOBACILLUSИ BIFIDOBACTERIUM ПО ИХ СПОСОБНОСТИ СИНТЕЗИРОВАТЬ ГАММА-АМИНОМАСЛЯНУЮ КИСЛОТУ -ОДИН ИЗ ПОДХОДОВ В ПОЛУЧЕНИИ ПСИХОБИОТИКОВ

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) является активным биогенным веществом; она синтезируется в организме растений, грибов, бактерий, основными ее продуцентами среди бактерий являются молочнокислые бактерии. ГАМК обладает антигипертензивными, анальгетическими и антидепрессантными свойствами. Лактобациллы - продуценты ГАМК - выделены из многих пищевых продуктов (сыров, йогуртов, заквасок); они обусловливают пищевые и биоактивные свойства этих продуктов. Такие штаммы рассматриваются как вектор доставки ГАМК в нужное место в кишечнике, они могут быть использованы как средство, способствующее адаптации человека на Крайнем Севере. Способность синтезировать ГАМК лактобациллами и бифидобактериями, явлющимися компонентами микробиоты человека, практически не изучена. В данной работе была проверена коллекция из 114 штаммов лактобацилл и бифидобактерий; показано, что способностью синтезировать ГАМК обладают все представители видов L.plantarum, L.brevis, B.adolescentis, B.angulatum, B.dentium (58 штаммов). Наибольшее количество ГАМК продуцировали штаммы бифидобактерий (до 6 г/л). Отобран один ГАМК-продуцирующий штамм L.plantarum 90sk, и показано, что его прием крысами линии Спрэг-Доули приводит к повышению в их крови уровня ГАМК и снижению уровня гормона стресса пролактина.

Полный текст

Стрессы при продолжительном воздействии на организм человека приводят к развитию ряда неврологических заболеваний, в частности депрессии и тревож- ным расстройствам [16]. Экологические стрессоры (низкие температуры, изме- нение фотопериодизма, магнитного поля и излучения), характерные для Край- него Севера, являются одной из причин развития у человека так называемого синдрома полярного напряжения. Это состояние характеризуется глубокими на- рушениями процессов на клеточном уровне и выражается утомляемостью, на- рушением сна, депрессией, тревожным состоянием и др. Депрессивное состояние сопровождается рядом физиологических изменений: активизацией вегетативной нервной системы, изменением гормонального статуса, активизацией гипотала- мо-гипофизарно-адреналовой системы, изменениями в составе кишечной микро- биоты, увеличением количества адреналина, снижением активности ГАМК- рецепторов, снижением количества инсулина в крови [1].51Вестник РУДН, серия Экология и безопасность жизнедеятельности, 2016, № 4Применение лекарств-антидепрессантов, несмотря на их эффективность, име- ет ряд недостатков: эффект привыкания, побочные эффекты. Поиск новых ле- карственных средств крайне важен. Такими принципиально новыми лекарствен- ными средствами являются пробиотические бактерии, преимущественно лакто- бациллы и бифидобактерии, в достаточных количествах способные оказывать благоприятное воздействие на здоровье пациентов. Пробиотики все чаще ис- пользуются в комбинированном лечении начальных стадий различных сомати- ческих заболеваний [2]. Преимуществом использования пробиотиков в качестве лекарственных средств является их относительная безвредность и физиологич- ность по сравнению с химическими препаратами.Совокупность населяющих тело человека микроорганизмов (преимуществен- но бактерий) - микробиом (микробиота) - играет чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности организма [18]. Бактерии кишечного микробиома участвуют не только в регуляции общего метаболизма и иммунитета, но и в функциониро- вании нервной системы хозяина [5; 14]. Кишечный микробиом рассматривается в настоящее время как часть так называемой оси «кишечник - мозг (gut - brain axis)» - двунаправленной коммуникационной системы, обеспечивающей слож- ное функционирование ЦНС и ЖКТ [9; 10]. Отдельные штаммы пробиотических бактерий способны положительно влиять на эмоциональное поведение, воспри- ятие боли, стресса у лабораторных животных [4]. Есть данные о подобном действии пробиотиков, так называемых психобиотиков на людей [8; 13; 15]. Взаимодей- ствие бактерий кишечной микробиоты и нервной системы организма-хозяина осуществляется посредством синтезируемых бактериями низкомолекулярных веществ, нейромедиаторов и гормоноподобных веществ; к ним относятся аце- тилхолин и другие холины, серотонин, норадреналин, гистамин и другие амины, жирные кислоты с короткими цепями, гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) [10]. Секретируемые бактериями нейротрансмиттеры могут непосредственно дей- ствовать на нервные окончания в ЖКТ, а также стимулировать эпителиальные клетки кишечника, которые в ответ высвобождают молекулы, модулирующие нейропередачу в энтеральной нервной системе, оказывая влияние на мозг и по- ведение человека. Такого рода бактерии следует рассматривать как систему до- ставки нейроактивных соединений в нужное место (клетки энтеральной нервной системы), обладающую профилактическим и терапевтическим потенциалом в отношении неврологических и нейрофизиологических расстройств.Материалы и методыШтаммы бактерий и условия культивирования. В работе были использованы 114 штаммов 16 видов лактобацилл и бифидобактерий, выделенных из фекалий, слюны и вагинального содержимого жителей центрального региона РФ, а также 3 штамма из коллекции ATCC. Лактобациллы и бифидобактерии выращивали в жидкой и на агаризованной среде MRS [6] при 37 °С в течение 24-48 час. в ана- эробных условиях, обеспечивающих атмосферу, содержащую 10% СО2 (HiAnaerobic System - Mark III, HiMedia, India). Для бифидобактерий в среду добавляли 0,05% цистеина. При проверке способности штаммов к синтезу ГАМК в среду добав-52Юнес Р.А., Полуэктова Е.У., Дьячкова М.С. и др. Отбор бактерий-симбионтов рода Lactobacillus...ляли 1% предшественника ГАМК мононатриевой соли глютаминовой кислоты. PLP добавляли в MRS в концентрации 0,5 мМ.Тонкослойная хроматография и определение количества ГАМК. Для разделения аминокислот в культуральной жидкости штаммов и идентификации ГАМК про- водили тонкослойную хроматографию на стеклянных пластинах со слоем сили- кагеля (TLC plates Silica gel 60 F254 Merck, Germany). В качестве растворителя использовали н-бутанол, уксусную кислоту и воду (4:1:1). Нингидрин добавляли в элюирующую смесь в концентрации 0,2%. Для измерения количества ГАМК в образцах использовали двумерное сканирование пластинок на денситометре Shimadzu CS-930, Japan (λ = 512).Опыты на крысах линии Спрэг-Доули. Опыты на животных проводили на кры- сах линии Спрэг-Доули; штаммом сравнения был пробиотический штамм L.rhamnosus GG, неспособным к синтезу ГАМК. В течение 15 дней 3 группы крыс (по 10 крыс в группе) получали соответственно стерильную питательную среду MRS, пробиотичесикй штамм L.rhamnosus GG и штамм L.plantarum 90sk. Первые две группы служили контролем. Бактериальные штаммы вводили ежедневно кры- сам через зонд в количестве 109 степени КОЕ. Стрессовым фактором служил хо- лодовой шок, индуцированный у крыс в результате снижения температуры до-40 °С в течение 45 сек. в последние 10 дней опыта. После этого крыс умерщвляли и удаляли из них кровь для измерения в ней уровня ГАМК и гормона стресса про- лактина.Результаты и обсуждениеИспользуя хроматографию на силикагеле, мы проверили коллекцию из 13 ви- дов лактобацилл и 3 видов бифидобактерий, выделенных из организма людей, на способность синтезировать и секретировать в среду ГАМК (табл. 1). Способностью секретировать ГАМК обладали 58 штаммов из 114 проверенных. Эта способность была видоспецифична, ею обладали виды L.plantarum, L.brevis и B.adolescentis, B.angulatum, B.dentium. Из 21 проверенного штамма L.fermentum, 28 штаммов L.rhamnosus и 11 штаммов L.casei ни один не секретировал ГАМК; не секретиро- вали ГАМК и единичные проверенные штаммы L.buchneri, L.helveticus, L.salivarius, L.sakei, L.reuteri, L.mucosa, L.crispatus, L.gasseri.Таблица 1Скрининг штаммов лактобацилл и бифидобактерий, способных к синтезу ГАМКВид лактобацилл и бифидобактерииКоличество проверенных штаммовКоличество штаммов-продуцентов ГАМКL. fermentum210L. rhamnosus280L. plantarum3030L. brevis33L. casei110L. helveticus20L. salivarius40L. sakei10L. reuteri30L. mucosa1053Вестник РУДН, серия Экология и безопасность жизнедеятельности, 2016, № 4Окончание табл. 1Вид лактобацилл и бифидобактерииКоличество проверенных штаммовКоличество штаммов-продуцентов ГАМКL. crispatus20L. buchneri30L. gasseri10B. adolescentis2121B. angulatum33B. dentium11Total11458Концентрация ГАМК в среде роста колебалась от 50 до 6000 мкг/мл. У лакто- бацилл она была больше у штаммов L.brevis (до 675 мкг/мл), чем у L. plantarum (до 300 мкг/мл); у бифидобактерий она была значительно выше (2500-6000 мкг/ мл) (табл. 2).Таблица 2Определение количества ГАМК, синтезируемой лактобациллами и бифидобактериямиВиды бактерийШтаммыУровень ГАМК, μg/млLactobacillus plantarum29st, 50/2, k13, 75sk, 14/4, 36st, 19/1A, 106zv,38/1До 5046sk, 3/1, 7/1, 52/1, CS396, K9L, 50st3, 43/3,119, 43/2, 56/151-1008-PA-3, 46k, 42/2, 191g, 57/1101-15043/5, 32sk, 43/4, 90sk, 29sk151-300Lactobacillus brevis47st,52st,50-10015f675Bifidobacterium adolescentis56, 174, 191, 104, 76,S11До 900108, 282, 48-2, 110, 44, S14, km4, 277, 44-2901-300057, 48, Tv29, km5-1, 152, 1503001-6000Bifidobacterium angulatum334-1, 212, GT1022616-3469Bifidobacterium dentium92465Лактобациллы, выделенные из продуктов питания (сыров, йогуртов, заквасок, традиционных продуктов корейской и китайской кухонь kimchi и paocai), демон- стрировали высокий уровень синтеза ГАМК. Максимальное количество ГАМК - 129 г/л - было получено у штамма L.buchneri WP2001 [19]. Для L.brevis макси- мальное количество ГАМК демонстрировали штаммы NCL912 и K203, 35,6 и 44,4 г/л соответственно [11; 19]. Для L.plantarum наибольшее количество ГАМК составило 0,5 г/л [3] и 1,16 г/л для штамма, содержащего дополнительный кло- нированный на плазмиде ген gadB [17]. Продукция ГАМК штаммами лактобацилл и бифидобактерий, выделенными из организма человека, была описана только в статье Barrett et al., 2012 и составила 32 г/л для L.brevis и 2,0-8,6 г/л для B.infantis, B.angulatum, B.dentium. Среди выделенных нами штаммов наблюдался значитель- ный разброс в количестве синтезируемой ГАМК. Для L.plantarum эти цифры были сходны с теми, которые были получены для штаммов, выделенных из продуктов питания, для L.brevis они были ниже; наибольшее количество ГАМК продуциро- вали штаммы бифидобактерий (B.angulatum, B.adolescentis, B.dentium) - до 6 г/л.54Юнес Р.А., Полуэктова Е.У., Дьячкова М.С. и др. Отбор бактерий-симбионтов рода Lactobacillus...На основе способности синтезировать ГАМК и других пробиотичнеских свой- ствах (антагонистическая, антиоксидантная активность) был отобран штамм L.plantarum 90sk. Для проверки предполагаемого антидепрессивного эффекта ГАМК-продуцирующего штамма L.plantarum 90sk были проведены опыты на кры- сах линии Спрэг-Доули (см. Материалы и методы, рис. 1).Рис. 1. Схема опыта по определению влияния штаммаL.plantarum 90sk на крыс в условиях холодового шокаμ mol/L2,521,510,5p < 0,05p < 0,010MRS L.rhamnosus GG L.plantarum 90skРис. 2. Количество ГАМК в крови крыс Спрэг-Доули по окончании опытаУровень ГАМК в крови крыс, получавших ГАМК-продуцирующий штамм, был достоверно выше по сравнению с двумя контрольными группами (MRS и L.rhamnosus GG) (см. рис. 2).55Вестник РУДН, серия Экология и безопасность жизнедеятельности, 2016, № 4Количество измеренного гормона стресса пролактина в крови крыс, получав- ших штамм L.plantarum 90sk, было достоверно ниже, чем у крыс, получающих стерильную среду MRS и штамм L.rhamnosus GG (рис. 3).ng/ml 16p < 0,0514121086420p < 0,05MRS L.rhamnosus GG L.plantarum 90skРис. 3. Количество пролактина в крови крыс Спрэг-Доули по окончании опытаУвеличение содержания ГАМК в крови крыс опытной группы свидетельству- ет о том, что штамм L.plantarum 90sk синтезировал ГАМК в кишечнике, которая затем попала в русло крови. Снижение уровня пролактина в крови крыс опытной группы говорит об адаптации крыс к стрессу, что хорошо описано в литературе [12]. Штамм L.plantarum 90sk является потенциальным психобиотиком, способ- ным облегчить синдром полярного напряжения, тем самым способствуя адапта- ции человека в условиях Крайнего Севера.
×

Об авторах

Р А Юнес

Институт общей генетики им.Н.И. Вавилова РАН; Российский университет дружбы народов

ул. Губкина, д. 3, Москва, Россия, 119991; Подольское шоссе, 8/5, Москва, Россия, 113093

Е У Полуэктова

Институт общей генетики им.Н.И. Вавилова РАН

ул. Губкина, д. 3, Москва, Россия, 119991

М С Дьячкова

Институт общей генетики им.Н.И. Вавилова РАН

ул. Губкина, д. 3, Москва, Россия, 119991

Ю Е Козловский

НИИ морфологии человека

ул. Цюрупы, д. 3, Москва, Россия, 117418

В С Орлова

Российский университет дружбы народов

Подольское шоссе, 8/5, Москва, Россия, 113093

В Н Даниленко

Институт общей генетики им.Н.И. Вавилова РАН

ул. Губкина, д. 3, Москва, Россия, 119991

Список литературы

  2. Казначеев В.П. Современные аспекты адаптации. Новосибирск: Наука, 1980. 191 с.
  3. Сапов И.А., Новиков В.С. Неспецифические механизмы адаптации человека. Л.: Наука, 1984. 146 с.
  4. Binh T.T., Ju W.T., Jung W.J., Park R.D. Optimization of γ-amino butyric acid production in a newly isolated Lactobacillus brevis // Biotechnol Lett 2014. № 36. P. 93-98.
  5. Carabotti M., Scirocco A., Maselli M.A., and Severi C. The gut-brain axis: interactions between enteric microbiota, central and enteric nervous systems // Ann Gastroenterol. 2015. 28(2). P. 203-209.
  6. Cryan J.F., Dinan T.G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour // Nat Rev Neurosci. 2012. 13(10). P. 701-712.
  7. De Man J.C., Rogosa M. & Sharpe M.E. A medium for the cultivation of lactobacilli // J Appl Bacteriol 1960. 23. P. 130-135.
  8. Di Cagno R., Mazzacane F., Rizzello C.G., Angelis M.D.E., Giuliani G., Meloni M., Servi B.D.E., Marco G. and Synthesis of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications // Appl.Microbiol. Biotechnol. 2010. 86. P. 731-741.
  9. Dinan T.G., Stanton C., Cryan J.F. Psychobiotics: a novel class of psychotropic // Biol Psychiatry. 2013. 74(10). P. 720-726.
  10. Douglas-Escobar M., Elliott E., Neu J. Effect of intestinal microbial ecology on the developing brain // JAMA Pediatr. 2013. 167(4). P. 374-379.
  11. Foster J.A., McVey Neufeld K.A. Gut-brain axis: how the microbiome influences anxiety and depression // Trends Neurosci. 2013. 36(5). P. 305-312.
  12. Li H., Li W., Liu X., Cao Y., gadA gene locus in Lactobacillus brevis NCL912 and its expression during fed-batch fermentation // FEMS Microbiol Lett. 2013. 349(2). P. 108-116.
  13. Maurizio F., Guaraldi G.P. Proclactin and stress // Medicine 1987. Jul-Sep 1987. 3(3). P. 211-216.
  14. Messaoudi M., Lalonde R., Violle N., Javelot H., Desor D., Nejdi A., Bisson J.F., Rougeot C., Pichelin M., Cazaubiel M., Cazaubiel J.M. Assessment of psychotropic-like properties of a probiotic formulation (Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175) in rats andhuman subjects // Br J Nutr. 2011 Mar. 105(5). P. 755-764.
  15. Nicholson J.K., Holmes E., Kinross J., Burcelin R., Gibson G., Jia W. et al. Host-gut microbiota metabolic interactions // Science 2012. 336. P. 1262-1267.
  16. Rao A.V., Bested A.C., Beaulne T.M., Katzman M.A., Iorio C., Berardi J.M., Logan A.C. A r and omized, double-blind, placebo-controlled pilot study of a probiotic in emotional symptoms of chronic fatigue syndrome // Gut Pathog. 2009. 1(1). P. 1-6.
  17. Schneiderman N., Gail I., Scott S. Stress and health: Psychological, behavioral, and biological determinants // Annu Rev Clin Psychol. 2005. 1. P. 607-628.
  18. Tajabadi N., Baradaran A., Ebrahimpour A., Rahim R.A., Bakar F.A., Manap M.Y., Mohammed A.S., Saari N. Overexpression and optimization of glutamate decarboxylase in Lactobacillus plantarum Taj-Apis362 for high gamma-aminobutyric acid production // Microb Biotechnol. 2015. 8(4). P. 623-632.
  19. Walter J. Ecological role of lactobacilli in the gastrointestinal tract: implications for fundamental and biomedical research // Appl Environ Microbiol. 2008. 74(16). P. 4985-4996.
  20. Zhao A., Hu X., Pan L., Wang X. Isolation and characterization of a gamma-aminobutyric acid producing strain Lactobacillus buchneri WPZ001 that could efficiently utilize xylose and corncob hydrolysate // Appl Microbiol Biotechnol. 2015. 99(7). P. 3191-3200.

© Юнес Р.А., Полуэктова Е.У., Дьячкова М.С., Козловский Ю.Е., Орлова В.С., Даниленко В.Н., 2016

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах