Research of the physico-chemical properties and microbiocenosis of cellulose-containing fiber - a by-product of the production of animal feed

Full Text

Введение Органические отходы жизнедеятельности в животноводстве сильно контаминированы по санитарно-бактериологическому состоянию. При правильном соблюдении условий компостирования патогенная микрофлора погибает [1]. Скорость разложения органических материалов, содержащих целлюлозу, зависит от активности членов микробного сообщества, которые требуют исследований [2]. Органические отходы садоводства и овощеводства (бахчевые и овощные культуры) являются ценным сырьем при получении масла с использованием масличных дрожжей Cryptococcus curvatus при начальном содержании углеводов в пределах 30-65 г/л [3]. Верно подобранный консорциум микроорганизмов для отхода органического происхождения - навоза крупного рогатого скота - способствует снижению численности патогенной микрофлоры и фиксирует атмосферный азот при компостировании [4]. Для отходов сельского хозяйства, являющихся вторичными материальными ресурсами, содержащими лигнин, целлюлозу, крахмал и пектин, применяются природные и специально выведенные штаммы микроорганизмов, которые осуществляют микробиологическую переработку растительной биомассы [5]. Катализатором расщепления целлюлозы в составе органических отходов являются ферменты целлюлаза и полисахаридмонооксигеназа [6]. С целью повышения выхода метана при анаэробном разложении органических отходов в биореакторе возможно создание постоянного электрического тока. Данный процесс носит название «электрометаногенез» [7]. Микроорганизмы способны восстанавливать высокотоксичные и растворимые в воде соли тяжелых металлов до менее токсичных и слабо растворимых солей в сточных водах и осадках. Для этих целей применяются сульфатредуцирующие бактерии [8]. В работе представлены результаты по использованию почвенных мицелиальных грибов родов Trichoderma, Aspergillus и Penicillium, их термостабильность и целлюлазная активность. Использованные приемы можно рекомендовать для экспресс-отбора перспективных штаммов. Отобраны четыре культуры моноспоровых изолятов мицелиальных грибов, полученных из природных резерватов, перспективные для включения в комплекс деструкторов для осуществления компостирования целлюлозосодержащих отходов и растительных остатков [9]. В работе [10] при создании искусственного почвогрунта использовались следующие компоненты: отход мокрой сепарации (15-20 %), глина (30-40 %), цитрогипс (10-15 %), песок (15-20 %), а в качестве источника органического вещества были использованы доступные нетоксичные отходы (растительные остатки). Полученная почвосмесь снижает антропогенное воздействие на окружающую среду и имеет приближенные характеристики, как у темно-серой лесной почвы. С использованием молекулярно-биологических методов установлено, что значительная часть бактерий, архей и микроскопических грибов в микробиоценозе компоста, представлена некультивируемыми видами (не выделены в чистые культуры). Начальную мезофильную стадию компостирования осуществляют мезофильные бактерии и грибы, которые в дальнейшем при повышении температуры замещаются термофилами [11]. Авторами исследованы оптимальные условия процесса совместного компостирования, осуществленного в II этапа, помета птицы и рисовой соломы. Рисовая солома вначале обрабатывалась грибами родов Trametes, Phanerochaete и Lentinus [12]. На примере сельскохозяйственных отходов, таких как кукурузный початок и жмых сахарного тростника, показана возможность получения бактериальной целлюлозы с использованием двух групп бактерий рода Komagataeibacter [13]. Выход бактериальной целлюлозы возрастает в два раза при культивировании бактерий рода Komagataeibacter совместно с бактериями, продуцирующими декстран (рода Leuconostoc) и ксантан (рода Xanthomonas). Питательной средой для культивирования служил побочный продукт - меласса [14]. Цель исследования - исследование процесса ферментации целлюлозосодержащего волокна. Задачи: 1) изучить физико-химические показатели целлюлозосодержащего волокна; 2) исследовать микробиоценоз путем посева водной вытяжки из образца на твердые агаризованные среды. Материалы и методы Целлюлозосодержащее волокно представляет собой плотно спрессованные влажные волокна с хлебным запахом, образуется в производстве кормовых добавок микробиологическим способом для животных. Данное волокно формируется из зерна злаковых культур после измельчения и частичной ферментации. На поверхности волокна в процессе хранения уже с первых дней контактирования с окружающей средой было обнаружено обрастание плесневыми мицелиальными грибами с характерным тухлым запахом. Рост мицелиальных грибов на поверхности волокна представлен на рис. 1, а-г. Наблюдались физическое разрушение и фрагментация растительного материала на более мелкие части, что обеспечивало большую площадь поверхности для колонизации микроорганизмами. В процессе разложения в окружающей среде в исследуемом целлюлозосодержащим волокне появились колонии мокриц рода Oniscidea (рис. 1, д), в среднем 60 особей на 1 кг образца. Обнаруженные членистоногие относятся к редуцентам. Для физико-химических и токсикологических исследований волокно было высушено при температуре 105 ºС (рис. 1, е). Были изучены физико-химические свойства волокна (табл. 1). Рис. 1. Рост мицелиальных грибов на поверхности волокна: a - второй день; б - третий день; в - десятый день; г - восемьдесят пятый день; д - мокрицы рода Oniscidea; е - образец после измельчения (размер фракции менее 5 мм) и высушивания при температуре 105 ± 2 °С Источник: фото И.Р. Курзенёва. Figure 1. Growth of mycelial fungi on the fiber surface: a - second day; б - third day; в - tenth day; г - the eighty-fifth day; д - genus of woodlice Oniscidea; е - sample after crushing (fraction size less than 5 mm) and drying at a temperature (105 ± 2)°С Source: photo by I.R. Kurzenev. Целлюлозосодержащее волокно состоит из следующих компонентов: вода - 47,00 %; органическое вещество (сложные углеводы, жиры) - 51,84 %; зола - 1,16 % (минеральные компоненты). В исследуемом образце преобладает содержание макроэлементов: азота - 2,43 %, фосфора - 1,90 %; содержание сложных углеводов следующее: крахмал - 25,10 %, клетчатка - 3,76 %. В водной вытяжке (1:10) из целлюлозосодержащего волокна содержание водорастворимых солей составляет 5,21 г/л. В технологическом процессе образования исследуемого продукта в производстве используется неорганическая кислота, которая влияет на значение pH солевой и водной вытяжки. Были изучены физико-химические свойства волокна (табл. 1). Таблица 1. Физико-химические свойства целлюлозосодержащего волокна Показатель, единица измерения Значение Азот/белок, % 2,43 ± 0,24*/13,85 ± 1,39* Крахмал, % 25,10 ± 5,02* Зола/Зола, нерастворимая в HCl, % 1,16 ± 0,14*/0,04 ± 0,01* Кальций, % 0,03 ± 0,01* Целлюлоза, % 3,76 ± 0,75* Фосфор, % 1,90 ± 0,38* Жиры, % 4,40 ± 1,23* Влажность, % 47,00 ± 9,40* pH водной вытяжки (1:5), pH 4,22 ± 0,20* pH водной вытяжки (1:10), pH 5,41 ± 0,20* pH KCl 1M (1:5), pH 4,56 ± 0,20* Солесодержание водной вытяжки (1:10), г/л 5,21 ± 1,04* Органическое вещество, % 51,84 ± 10,37* *Значения расширенной неопределенности при коэффициенте охвата k = 2 и уровне доверия приблизительно 95 %. Источник: составлено И.Р. Курзенёвым, Т.А. Василенко. Table 1. Physicochemical properties of cellulose fiber Properties, Unit of measurement Values Nitrogen/Protein, % 2.43 ± 0.24*/13.85 ± 1.39* Starch, % 25.10 ± 5.02* Ash/ Ash, Insoluble in HCl, % 1.16 ± 0.14*/0.04 ± 0.01* Calcium, % 0.03 ± 0.01* Cellulose, % 3.76 ± 0.75* Phosphorus, % 1.90 ± 0.38* Fat content, % 4.40 ± 1.23* Humidity, % 47.00 ± 9.40* pH Distilled water extract (1:5), pH 4.22 ± 0.20* pH Distilled water extract (1:10), pH 5.41 ± 0.20* pH Potassium chloride solution, 1M extract (1:5), pH 4.56 ± 0.20* Salinity Distilled water extract (1:10), г/л 5.21 ± 1.04* Оrganic matter, % 51.84 ± 10.37* *Standard coverage factor k = 2 can yield an expanded uncertainty corresponding to a coverage probability of less than 95 %. Source: compiled by I.R. Kurzenev, T.A. Vasilenko. В процессе хранения (который сопровождался гниением побочного продукта) влажность изменялась с 47 до 76%, а значение pH водной вытяжки (1:5) с 4,22 до 7,54 единиц pH. Высокое содержание влажности наблюдалось на 10-й день хранения. Увеличение влажности объясняется разложением растительного материала, которое сопровождается выделением воды и углекислого газа. Изучена корреляция влажности и pH (рис. 2). Зола, полученная при сжигании исследуемого образца при температуре (600 ± 5) °С, была проанализирована методом рентгеновской дифракции прибором ARL 9900 WorkStation (табл. 2). Исследование золы позволяет определить минеральную часть исследуемого образца, в котором преобладают следующие оксиды, %: SiO2 - до 51,30; P2O5 - до 17,63; Al2O3 - 10,25; CaO - 7,55; Na2O - 6,44; K2O - 4,05. Рис. 2. Динамика изменения pH водной вытяжки (1:5) и влажности целлюлозосодержащего волокна от количества дней естественной ферментации Источник: составлено И.Р. Курзенёвым, Т.А. Василенко. Figure 2. Dynamics of changes in pH of aqueous extract (1:5) and moisture content in cellulose-containing fiber depending on the number of days of natural fermentation Source: compiled by I.R. Kurzenev, T.A. Vasilenko. Таблица 2. Химический состав золы целлюлозосодержащего волокна Оксид Содержания, % SiO2 50,65 ± 2,53* P2O5 16,96 ± 0,85* Al2O3 10,12 ± 0,51* CaO 7,49 ± 0,38* Na2O 6,26 ± 0,31* K2O 3,97 ± 0,20* MgO 1,86 ± 0,19* SO3 1,16 ± 0,23* Fe2O3 0,82 ± 0,16* *Значения расширенной неопределенности при коэффициенте охвата k = 2 и уровне доверия приблизительно 95 %. Источник: составлено И.Р. Курзенёвым, Т.А. Василенко. Table 2. content of elements in ash of cellulose fiber oxides Value, % SiO2 50.65 ± 2.53* P2O5 16.96 ± 0.85* Al2O3 10.12 ± 0.51* CaO 7.49 ± 0.38* Na2O 6.26 ± 0.31* K2O 3.97 ± 0.20* MgO 1.86 ± 0.19* SO3 1.16 ± 0.23* Fe2O3 0.82 ± 0.16* *Standard coverage factor k = 2 can yield an expanded uncertainty corresponding to a coverage probability of less than 95%. Source: compiled by I.R. Kurzenev, T.A. Vasilenko. Определение токсичности водной вытяжки (1:10) из исследуемого образца проводилось в соответствии с требованиями аттестованных методик биотестирования на двух разных тест-объектах (табл. 3)[32]. По результатам биотестирования целлюлозосодержащие волокно относится к IV классу опасности (малоопасный). Таблица 3. Степень негативного воздействия на окружающею среду Тест-объект Продолжительность наблюдений, часы Оценка тестируемой пробы Ceriodaphnia affinis 48 Наличие острого токсического действия. Безвредная кратность разбавления -100 Chlorella vulgaris Beijer 22 Наличие токсического действия. Безвредная кратность разбавления -100 Источник: составлено И.Р. Курзенёвым, Т.А. Василенко. Table 3. The degree of negative impact on the environment Unit Hours after start of analysis conclusion Ceriodaphnia affinis 48 The harmless dilution factor is 100 Chlorella vulgaris Beijer 22 The harmless dilution factor is 100 Source: compiled by I.R. Kurzenev, T.A. Vasilenko. Результаты исследований В качестве оценки микробиологической активности был выполнен посев на твердых агаризированных средах: агар Сабуро; питательная среда № 1 ГРМ и агар Эндо-ГРМ. Посев водной вытяжки из целлюлозосодержащего волокна (аликвота 100-200 мкл в зависимости от разбавлений (10, 15, 20, 30 раз) осуществлялся в следующие дни после отбора: 1, 10, 20, 35-й. После посева на твердой питательной среде агар Сабуро водной вытяжки из исследуемого образца развивались плесневые грибы родов Penicillium, Cladosporium (рис. 3). Окраска колоний определяется главным образом цветом массы конидий и в меньшей степени - изменением с возрастом цвета мицелия и пигментов, выделяемых им в субстрат. Рис. 3. Колонии мицелиальных грибов родов Penicillium (а, б, е-з), Cladosporium (в, г) на среде Сабуро Источник: фото И.Р. Курзенёва. Figure 3. Colonies of mycelial fungi of the genus Penicillium (а, б, е-з), Cladosporium (в, г) Sabouraud agar Source: photo by I.R. Kurzenev. Микрофотографии спор и конидий представлены на рис. 4, для этих целей использовался микроскоп Levenhuk 870T с цифровой камерой Levenhuk C800 NG 8M. Характеристики колоний мицелиальных грибов следующие: - колонии рода Penicillium умеренно глубокие; плоские; края целые; мицелий в центре желтый, по краям белый; текстура хлопковая; реверс желтый; конидии в массе желтые; имеется экссудат (рис. 3, а, б). Микроскопическое строение гриба представлено на рис. 4, б; - колонии рода Cladosporium умеренно глубокие, плоские; края целые; мицелий черный; текстура хлопковая; реверс черный; конидии в массе темные; экссудат отсутствует (рис. 3, в, г). Было исследовано микроскопическое строение гриба (рис. 4, а); - колонии рода Penicillium умеренно глубокие; плоские; края целые; мицелий в центре буро-зеленый, по краям имеет сизо-зеленую окантовку; текстура хлопковая; реверс желтый; конидии в массе серо-зеленые; экссудат отсутствует (рис. 3 д, е). Микроскопическое строение гриба представлено на рис. 4, в; - колонии рода Penicillium умеренно глубокие; плоские; края целые; мицелий белый, состоящий из сплетений гиф, восходит над субстратом; реверс желтый; экссудат отсутствуют (рис. 3, ж, з). Микроскопическое строение гриба представлено на рис. 4, г. Рис. 4. Споры, спорангии и конидиеносцы мицелиальных грибов под микроскопом (увеличение 400x) родов Cladosporium (а) и Penicillium (б-г) Источник: фото И.Р. Курзенёва. Figure 4. Spores, sporangia and conidiophores of filamentous fungi under a microscope (magnification 400x) of the genera Cladosporium (а), Penicillium (б-г) Source: photo by I.R. Kurzenev. Для рода Penicillium характерно споровое строение (рис. 4, б-г), конидиеносцы септированные, на конце имеют кисточку, которая может быть трех- или четырехъярусная. Конидиеносцы заканчиваются одиночными клетками спор. Конидии рода Cladosporium формируются в виде длинных, практически не разветвленных конидиеносцев (рис. 4, а); конидии имеют бледно-оливковый цвет, гладкостенные. На твердой питательной среде ГРМ-агар после посева водной вытяжки из исследуемого образца были обнаружены предположительно дрожжи родов Saccharomyces, Schizosaccharomyces, с характерным «хлебным» запахом и бактерии рода Bacillus (рис. 5). Характеристики колоний рода Bacillus (рис. 5): колонии бактерий сухие, мелкоморщинистые, бархатистые, кремовые. Край колонии волнистый; диметр колоний от 3 до 12 мм. Рис. 5. Общий вид дрожжей родов Saccharomyces, Schizosaccharomyces и бактерий рода Bacillus в чашках Петри на среде ГРМ-агар Источник: фото И.Р. Курзенёва. Figure 5. General appearance of yeasts of the genera Saccharomyces, Schizosaccharomyces and bacteria of the genus Bacillus in Petri dishes on GRM agar medium Source: photo by I.R. Kurzenev. Характеристики колоний родов Saccharomyces, Schizosaccharomyces (см. рис. 5): форма колоний круглая; диаметр колоний от 2 до 9 мм; цвет молочный или белый; поверхность гладкая. При старении цвет колоний темнеет. Клетки рода Saccharomyces имеют овальную форму, а рода Schizosaccharomyces - палочковидную. Расчет количества колониеобразующих единиц на грамм растительного волокна (Х, КОЕ/г) с пересчетом на абсолютно сухую навеску осуществлялся по формуле X =Σ CFU ⋅10n , (1) V k⋅ где ∑ CFU - количество колоний в одной чашке, шт.; k - коэффициент пересчета на абсолютно сухую навеску (1 - W); W - влажность образца, доли единицы; n - степень разведения, из которого сделан посев; V - объем аликвоты водной вытяжки из образца. Результаты подсчета количества микроорганизмов представлена в табл. 4[33]. С увеличением количества дней экспонирования наблюдалась тенденция к увеличению числа микроорганизмов в растительном волокне (табл. 4). На твердой питательной среде Эндо после посева водной вытяжки из исследуемого образца на 35-й день естественной ферментации были обнаружены колонии энтеробактерий рода Escherichia: лактозоотрицательные бактерии розового оттенка (рис. 6, а) и лактозоположительные малиново-красные колонии с металлическом блеском (рис. 6, б). Был проведен экспресс-тест на обнаружение цитохромоксидазы бактерий с использованием полосок OXItest, результат теста - отрицательный. Окраска по Граму показала наличие грамотрицательных бактерий. Таблица 4. Расчет количества колониеобразующие единиц на грамм волокна на питательных средах Дни с момента ферментации Температура окружающей среды, °c ГРМ-агар, КОЕ/г Эндо-агар, КОЕ/г 1 +23 18·1015** - 10 +18 23·1020** - 30 +10 28·1020** - 35 +7 18·1030** 7·1015 ** При n = 20, p < 0,05. Источник: составлено И.Р. Курзенёвым, Т.А. Василенко. Table 4. colony-forming unit Days from the moment of selection Ambient temperature, °c growth medium beef-extract agar, cFU/g growth medium Endo agar, cFU/g 1 +23 18·1015** - 10 +18 23·1020** - 30 +10 28·1020** - 35 +7 18·1030** 7·1015 ** For n = 20, p < 0,05. Source: compiled by I.R. Kurzenev, T.A. Vasilenko. Рис. 6. Энтеробактерии рода Escherichia: a - лактозоотрицательные бактерии розового оттенка; б - лактозоположительные малиново-красные колонии с металлическим блеском Источник: фото И.Р. Курзенёва. Figure 6. Enterobacteriaceae of the genus Escherichia: a - lactose-negative bacteria of pink color; б - lactose-positive colonies of raspberry-red color with a metallic sheen. Source: photo by I.R. Kurzenev. Результаты исследований Целлюлозосодержащее волокно является побочным продуктом в производстве кормовых добавок микробиологическим способом для животных. Образуется из зерновых культур после ферментации. Продукт состоит из следующих компонентов: влажность - 47,00 %; зола - 1,16 %; органическое вещество - 51,84 % (в том числе крахмал - 25,10 %; жиры - 4,40 %). В золе преобладают оксиды: кремния SiO2 - до 51,30 %; фосфора P2O5 - до 17,63 %; алюминия Al2O3 - до 10,25 %. Содержание азота и фосфора в исследуемом образце составляет 2,43 и 1,90 %. Исследована зависимость изменения pH, влажности от времени хранения целлюлозосодержащего волокна. В процессе естественной ферментации увеличивается влажность с 47 до 76 %, а также стабилизируется значение pH с 4,22 до 7,54. Был изучен микробиоценоз путем посева водной вытяжки из образца на твердые агаризованные среды. Выявлены микроорганизмы, относящиеся к родам: Penicillium, Cladosporium, Bacillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces и Escherichia. Количество микроорганизмов возрастает с ростом срока хранения продукта, который является биоразлогаемым и подвержен гниению. Степень негативного воздействия на окружающую среду - IV.

About the authors

Ivan R. Kurzenev

Belgorod State Technological University named after V.G. Shukhov

Author for correspondence.
Email: spandwaryandex@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2975-8152
SPIN-code: 4233-9699

graduate student

46 Kostyukova St, Belgorod region, Belgorod, 308012, Russian Federation

Tatyana A. Vasilenko

Belgorod State Technological University named after V.G. Shukhov

Email: land-vna78@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-4908-4906
SPIN-code: 2911-5489

Candidate of Technical Sciences, Associate Professor

46 Kostyukova St, Belgorod region, Belgorod, 308012, Russian Federation

References

Supplementary files