Биохимическая оценка действия антибиотика эритромицина на моллюсков живородка речная (Viviparus viviparus L.)

Полный текст

Введение В животноводстве субтерапевтические дозы противомикробных препаратов играют важную роль в стимуляции роста и предотвращении болезней животных [1-3]. Литературные данные свидетельствуют о загрязнении антибиотиками, например эритромицином, сточных вод животноводства, которые вместе с паводковыми попадают в водные объекты. Эритромицин - один из антибиотиков, наиболее часто применяющихся в ветеринарии, о чем свидетельствует появление эритромицин-резистентных штаммов микроорганизмов в водоемах близ сельскохозяйственных территорий, а также в молоке коров [4-6]. Как и все антибиотики группы макролидов, эритромицин содержит лактонное кольцо, с которым через кислород соединены углеводные компоненты. В соответствии с классификацией эритромицин является 14-членным природным макролидом, продуцентом которого являются актиномицеты Streptomyces erythreus [7]. Литературные данные свидетельствуют о загрязнении антибиотиками, и в частности эритромицином, сельскохозяйственных предприятий и сточных вод, которые затем вместе с паводками попадают в водоемы и реки [4; 5; 8]. Появление антибиотиков в водных объектах приводит к различным негативным воздействиям на живые объекты, которое изучено в основном на рыбах [9], менее известны характер и степень воздействия антибиотиков на моллюсков. В связи с этим цель исследования - изучение токсического действия макролидного антибиотика эритромицина на активность кислых ДНКаз и РНКаз моллюсков живородка речная (Viviparus viviparus L.), которые широко распространены в водоемах Европейской части России и рассматривались в ряде исследований как биомаркеры загрязнения водной среды [10-14]. В работах [12; 13] показано, что активность ДНКазы является информативным показателем состояния гидробионтов при действии катионов тяжелых металлов. Объекты и методы исследования В настоящей работе для пресноводных моллюсков живородка речная исследовали изменение активности ферментов РНКазы и ДНКазы при воздействии эритромицина в течение 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72 и 96 ч. В качестве материала для исследования были использованы гомогенаты тканей пищеварительной железы (гепатопанкреаса) пресноводных моллюсков живородка речная. В качестве токсиканта был использован эритромицин (препарат эритромицина (Синтез, Россия)) в концентрации, соответствующей 10 ПБКвод. (предельно безопасная концентрация для водных объектов) (РNECaq) ПБКвод - 0,0002 мг/дм3 [15]. Контрольная группа моллюсков содержалась в воде без добавления токсиканта. По истечении установленных промежутков времени моллюсков препарировали и извлекали пищеварительную железу. Ткани гомогенизировали в фарфоровой ступке в течение 5 мин растиранием с битым кварцевым стеклом и экстрагирующей жидкостью (0,5%-й раствор Тритон Х-100 на дистиллированной воде, прибавляемый в десятикратном объеме по отношению к навеске ткани). Экстракты очищали центрифугированием при 10 000 g и 4 °С в течение 30 мин на рефрижераторной центрифуге [11]. Концентрацию белка в экстрактах определяли методом Лοури [16]. Активность РНКазы определяли модифицированным методом Анфинсена по изменению оптического поглощения раствора, в котором находятся кислоторастворимые продукты гидролиза высокомолекулярной РНК, при 260 нм на спектрофотометре «Thermo Genesis 6» [17]. Активность ДНКазы измеряли флуориметрически [18], используя в качестве субстрата синтетический одноцепочечный олигодезоксирибонуклеотид Rsol-P (TTCGCCTACGAATTTCAAGCC) («BioBeagle»), меченный парой флуорофоров: сигнальным красителем 6-FAM (6-карбоксифлуоресцеин, λмакс.поглощения = 490 нм, λмакс. флуоресценции = 520 нм) на 5'-конце и тушителем флуоресценции BHQ-1 (Black Hole Quencher, λмакс. поглощения = 535 нм, диапазон гашения 480-580 нм) на 3'-конце (аналогично зондам TaqMan-типа) на спектрофлуориметре «Флюорат-02-Панорама» при длинах волн 492 нм (поглощение света) и 520 нм (флуоресценция). За единицу активности РНКазы принимали такое количество фермента, которое вызывает увеличение поглощения раствора на единицу оптической плотности при 260 нм за 1 мин. За единицу активности ДНКазы принимали такое количество фермента, которое катализировало превращение 1 моль субстрата за 1 мин. Удельную активность ферментов рассчитывали в единицах на 1 мг белка (Е/мг белка). Все биохимические исследования проводили в пяти биологических и трех аналитических повторностях. Изменение удельной активности нуклеаз моллюсков под действием эритромицина сравнивали с контрольными значениями в соответствующих временных интервалах. Статистическую обработку проводили при помощи программы Microsoft Office Excel. Результаты представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение». Достоверность результатов определяли по t-критерию Стьюдента. Различия между средними значениями считали достоверными, если уровень значимости был более 95 % (p < 0,05). Результаты и их обсуждение При анализе изменений активности РНКазы у моллюсков опытной группы по сравнению с моллюсками контрольной группы (рис. 1) выявлено незначительное увеличение активности между контрольной и опытной группами моллюсков в период экспозиции от 0 до 24 ч, что свидетельствует о незначительном влиянии эритромицина на активность РНКазы при непродолжительном воздействии. Необходимо отметить, что активность РНКазы увеличивается с 48 ч экспозиции и остается выше контрольных значений до конца эксперимента. В целом действие эритромицина приводит к незначительному увеличению активности РНКазы. Исследование изменения удельной активности ДНКазы пищеварительной железы живородки речной (рис. 2) в опытной группе моллюсков выявило выраженное чередование фаз активности фермента. На протяжении всего времени экспозиции наблюдается увеличение активности ДНКазы примерно в 3-4 раза по сравнению с контрольными значениями. Изображение выглядит как текст, линия, График, диаграмма Автоматически созданное описание Рис. 1. Изменение удельной активности РНКазы под действием эритромицина в концентрации, соответствующей 10 ПБКвод. Различия между значениями удельной активности фермента статистически значимы при р ≤ 0,05 в экспозиции 4, 72 и 96 ч Источник: составлено Е.А. Тишиной, Т.С., Дрогановой, Л.В. Поликарповой., А.Л. Петровым Figure 1. Change in specific activity of RNase under the influence of erythromycin at a concentration corresponding to 10 РNECaq. The differences between the specific enzyme activity values are statistically significant at p ≤ 0.05 at exposure of 4, 72 and 96 hours Source: compiled by Е.А. Tishina, T.S. Droganova, L.V. Polikarpova, A.L. Petrov. Изображение выглядит как текст, График, линия, диаграмма Автоматически созданное описание Рис. 2. Изменение удельной активности ДНКазы под действием эритромицина в концентрации, соответствующей 10 ПБКвод. Различия между значениями удельной активности фермента статистически значимы при р ≤ 0,05 во всех точках экспозиции Источник: составлено Е.А. Тишиной, Т.С., Дрогановой Л.В., Поликарповой., А.Л. Петровым. Figure 2. Change in specific activity of DNase under the influence of erythromycin at a concentration corresponding to 10 РNECaq. The differences between the specific enzyme activity values are statistically significant at p ≤ 0.05 at all exposure points Source: compiled by Е.А. Tishina, T.S. Droganova, L.V. Polikarpova, A.L. Petrov. Результаты, полученные в ходе эксперимента, согласуются с данными об острой токсичности макролидов для гидробионтов [9] и показывают изменение удельной активности обоих исследуемых ферментов, что является реакцией на воздействие эритромицина. Полученные результаты соотносятся с данными, полученными ранее при изучении изменения активности нуклеаз под воздействием неорганических токсикантов: катионов Zn2+ [13] и Pb2+ [12] и литературными данными [19; 20]. Заключение Изменение активности ДНКазы можно использовать в качестве маркера загрязнения водоемов макролидными антибиотиками, в частности эритромицином. При этом индикация загрязнений по изменению активности РНКазы может быть затруднительна. На основании результатов, полученных в ходе исследования, было установлено токсическое действие эритромицина на живородку речную (Viviparus viviparus L.), а также показана возможность использования изменения активности нуклеаз гепатопанкреаса живородки речной в качестве маркера загрязнения водных экосистем.

Об авторах

Екатерина Александровна Тишина

Государственный университет просвещения

Email: 89266182591@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8329-7855

заведующая учебной лабораторией прикладной химии

Российская Федерация, 141014, Московская обл., г. Мытищи, ул. Веры Волошиной, д. 24

Татьяна Сергеевна Дроганова

Государственный университет просвещения

Автор, ответственный за переписку.
Email: tatyanadroganova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8917-7392
SPIN-код: 2250-9950

старший преподаватель кафедры теоретической и прикладной химии

Российская Федерация, 141014, Московская обл., г. Мытищи, ул. Веры Волошиной, д. 24

Людмила Викторовна Поликарпова

Государственный университет просвещения

Email: judmilapolikarpova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5459-3054
SPIN-код: 9605-2840

научный сотрудник учебно-научной лаборатории экологической биохимии

Российская Федерация, 141014, Московская обл., г. Мытищи, ул. Веры Волошиной, д. 24

Андрей Леонидович Петров

Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген»

Email: unodeldiablo@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-8219-8876

лаборант производства бактерийных препаратов

Российская Федерация, 127473, г. Москва, 2-й Волконский переулок, д. 10

Список литературы

Дополнительные файлы