Different effects of methionine isomers on biochemical and cytological indices of blood in experimental animals

Natalya N. Chuchkova; Чучкова Н. Н.; Ksenia A. Pazinenko; Пазиненко К. А.; Marina V. Smetanina; Сметанина М. В.; Natalya V. Kormilina; Кормилина Н. В.; Oleg A. Pazinenko; Пазиненко О. А.

doi:10.22363/2313-0245-2025-30-3-386-395

Различный эффект влияния изомеров метионина на биохимические и цитологические показатели крови экспериментальных животных

Авторы: Чучкова Н.Н.¹, Пазиненко К.А.¹, Сметанина М.В.¹, Кормилина Н.В.¹, Пазиненко О.А.¹
Учреждения:
1. Ижевский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 30, № 3 (2026): КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
Страницы: 386-395
Раздел: Физиология
URL: https://journals.rudn.ru/medicine/article/view/52071
DOI: https://doi.org/10.22363/2313-0245-2025-30-3-386-395
EDN: https://elibrary.ru/KXZLKL
ID: 52071

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Актуальность. Избыток метионина, поступающего в организм (с пищей, лекарствами, биодобавками), сопровождается токсическим накоплением гомоцистеина и неблагоприятными эффектами, приводящими к формированию патологии ряда систем. Сравнительному влиянию изомеров метионина посвящено незначительное количество работ. Цель исследования: установить особенности биологического действия изомеров метионина, используемого в качестве пищевой биодобавки, на биохимические и цитологические показатели крови экспериментальных животных. Материалы и методы. Экспериментальные крысы получали добавку к корму с повышенным содержанием метионина в виде DL-формы (рацемат DL-метионина, Бельгия), либо L-формы (100 % L-метионин, Fingres Biotech Inc, Китай) в количестве 0,15г/100г массы животного. У контрольных животных прикорм не содержал добавок. Через 25 дней у животных под эфирным наркозом транскардиальной пункцией забирали кровь. Определяли: концентрацию гомоцистеина (Axis-Shield PLC (Великобритания)); проводили цитологический анализ белой крови и красной крови (гематологический анализатор System XS-500i (Япония)); для качественной оценки мазки крови окрашивали с помощью гематологического красителя Лейкодиф-200 (Lachema, Чехия) и просматривали в микроскопе Carl Zeiss (Германия) при увеличении × 1000. Рассчитывали индекс аллергизации организма и нагрузочный эритроцитарный коэффициент. Статистический анализ проводили с использованием методов анализа на нормальность распределения данных по Шапиро-Уилка, однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, множественные сравнения проводились с помощью теста Тьюки. Результаты и обсуждение. Введение рацемической смеси DL-метионина привело к повышению гомоцистеина в крови до 28,9 ± 2,65 (р = 0,05), L-формы до 79,38 ± 3,91 (р = 0,05) мкмоль/л (в контроле 8,5 ± 0,6 мкмоль/л). В крови животных 1-й группы было выявлено повышение абсолютного числа гранулоцитарных форм лейкоцитов (в 1,4 раза, p = 0,049), отмечался нейтрофилез. При введении L-формы метионина у животных было резко снижено как абсолютное (в 3,7 раза в сравнении с контрольной группой, p = 0,01), так и относительное количество нейтрофилов, отмечено появление гиперсегментированных форм нейтрофилов и незрелых форм эозинофилов. В обеих группах проявилась аллергическая настроенность организма, более выраженная у животных с введением L-формы метионина, индекса аллергизации был повышен на 49,2 ± 3,61 % (р = 0,01). При введении L-формы снижалось количество тромбоцитов; увеличивалась СОЭ; на 15,7 % (p = 0,043) повышался нагрузочный эритроцитарный коэффициент. Выводы. Таким образом, выраженность гипергомоцистеинемии, направленность ответных реакций белой и красной крови, коэффициентов, отражающих аллергическую настроенность организма и функциональную эритроцитарную нагрузку при избыточном введении метионина в качестве биодобавки, определяются формой изомера, входящего в ее состав.

Ключевые слова

DL-метионин, L-метионин, гипергомоцистеинемия, клинический анализ крови

Полный текст

Введение

Метионин — незаменимая аминокислота, избыток которой приводит к повышению гомоцистеина (ГЦ) в плазме крови. Токсическое накопление ГЦ играет ключевую роль в возникновении и прогрессировании различных патологических состояний: атеросклеротических повреждений, сердечно-сосудистой и нейродегенеративной патологии, тромботических изменений [1–4]. Диапазон гипергомоцистеинемии (гиперГЦ), рассматривающийся как предиктор заболеваний, очень широк. Так, показатели ГЦ от 15 мкмоль/л до 100 мкмоль/л обозначают как умеренную, свыше 100 мкмоль/л — тяжелую гипергомоцистеинемию. Тяжелая форма гипер ГЦ, опосредуется главным образом генетическими причинами, сопряжена с дефектами фолатного цикла, связана с тяжелым поражением почек и встречается достаточно редко. Наиболее распространенной является умеренная форма гиперГЦ, нижнюю границу которой в настоящее время предлагают снизить с 15 до 10 мкмоль/л [3]. Умеренная гиперГЦ является следствием диетических, поведенческих и патологических состояний; на уровень ее развития влияют возраст, пол, прием лекарственных препаратов или БАДов [5]. Однако до сих пор не ясно, является ли умеренно повышенная концентрация гомоцистеина в плазме первопричиной или просто маркером связанного с ней патологического состояния, которое может предрасполагать к развитию сосудистых заболеваний, или их осложнений. В связи с вышеизложенным актуальными являются исследования на животных-моделях с повышенным количеством ГЦ в крови. Для этого используются подходы, связанные, например, с диетическими нарушениями [6, 7], нокаутные модели мышей и крыс [8], вариации в использовании животных разных видов с неодинаковой чувствительностью к метионину [9].

Метионин содержит асимметрический атом углерода, обладает оптической активностью и существует в виде двух энантиомеров (изомеров) — L- и D-метионина. В живых организмах встречается преимущественно в L-форме. Феномен различия в биологическом действии лекарственных препаратов, обусловленный оптической изомерией вещества, хорошо описан [10, 11]. Разнонаправленные и неоднозначные эффекты изомеров метионина, используемых в качестве пищевой добавки, добавляемой в прикорм животным, при одинаковой их биодоступности [12] отражены в ряде работ [13, 14].

Цель исследования — установить особенности биологического действия изомеров метионина, используемого в качестве биологической добавки, на биохимические и цитологические показатели крови экспериментальных животных.

Материал и методы

Эксперимент выполнен на 52 белых крысах Rattus norvegicus Berk обоего пола, содержащихся в виварии ФГБОУ ВО ИжГМУ, в осенне-зимний период (октябрь–декабрь). Содержание животных осуществлялось в соответствии с нормативным документом СП 2.2.1.321814 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29 августа 2014 г. № 51.

Масса животных на момент введения в эксперимент составляла 220 ± 20 г. Крысы находились в одинаковых условиях содержания, получали экструдированный корм (ПК‑120 ГОСТ Р 51849–2001 Р.5) при свободном доступе к воде. Все эксперименты выполнены в соответствии с Женевской конвенцией «Internetional Guiding Principals for Biomedical Involving Animals» (Geneva, 1990), а также Хельсинской декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации о гуманном отношении к животным (редакция 2000 г.). Исследование одобрено комитетом по биомедицинской этике ФГБОУ ВО «Ижевская государственная медицинская академия» Минздрава РФ (протокол № 656 от 23.04.2019).

Животным ежедневно индивидуально скармливали шарики из сырого свиного мясного фарша весом 15,0 ± 0,5 г. У контрольных животных прикорм не содержал добавок, у крыс экспериментальной группы № 1 в фарш добавляли DL-метионин (DL), содержащий в равных количествах D и L формы (99 % DL-метионин, Бельгия), у экспериментальной группы № 2 в прикорм вводили L-метионин (L) (100 % L-метионин, Fingres Biotech inc) в количестве 0,15г/100г массы животного. Одновременно крысы получали 1 % раствора соответствующей формы метионина в воде в качестве питья. Через 25 дней у экспериментальных животных и интактных крыс под эфирным наркозом транскардиальной пункцией забирали кровь. Концентрацию гомоцистеина определяли иммуноферментным методом с использованием тест-системы Axis-Shield PLC (Великобритания); клинический цитологический анализ белой крови и красной крови проводили на гематологическом анализаторе System XS‑500i (Япония); для качественной оценки мазки крови дополнительно окрашивали с помощью гематологического красителя Лейкодиф‑200 (Lachema, Чехия) и просматривали в микроскопе Carl Zeiss Primo Star (Carl Zeiss, Германия) при увеличении × 1000. Рассчитывали индекс аллергизации организма (ИАО) и нагрузочный эритроцитарный коэффициент (НЭК). ИАО определяли по формуле: Лимфоциты + 10 × (Эозинофилы + 1)/(Нейтрофилы + Моноциты + Базофилы) [15]. Для определения НЭК использовали показатели скорости оседания эритроцитов (СОЭ) и уровень гемоглобина по формуле: СОЭ (мм/ч) × 10 / Гемоглобин,% [16].

Статистический анализ проводили с использованием методов анализа на нормальность распределения данных по Шапиро-Уилку, однофакторного дисперсионного анализа ANOVA, множественные сравнения проводились с помощью теста Тьюки. Данные считались достоверными при р ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение

Введение экспериментальным животным рацемической смеси DL (50 %/50 %) форм метионина (экспериментальная группа № 1) и 100 % L-формы аминокислоты (экспериментальная группа № 2) привело к формированию гиперГЦ с разной концентрацией гомоцистеина в крови. Так, у интактных крыс концентрация ГЦ составила 8,5 ± 0,6, в экспериментальной группе № 1–28,9 ± 2,65 (в 3,4 раза выше, р = 0,05) в экспериментальной группе № 2–79,38 ± 3,91 мкмоль/л (в 9,3 раза выше интактного контроля, р = 0,005).

Цитологический анализ крови животных с DL- и L-индуцированной формой гиперГЦ выявил существенные различия в количестве и видах гранулоцитов и агранулоцитов белой крови. Клеточный состав белой крови представлен в табл. 1.

Таблица 1 / Table 1
Показатели белой крови животных при введении DL (1 эксперимент) и L (2 эксперимент) форм метионина /
White blood indices of animals with the administration of DL (1 experiment) and L (2 experiment) forms of methionine

Показатели/Indicators	Контроль/Control	Эксперимент 1/Experiment 1	Эксперимент 2/Experiment 2
Лейкоциты(10⁹/л)/ Leukocytes(10⁹/l /%)	10,79 ± 2,24	13,75 ± 1,76* (p = 0,046)	10,71 ± 1,12# (p = 0,001)
Лимфоциты (10⁹/л /%)/Lymphocytes(10⁹/l /%)	6,51 ± 0,90/59/39 ± 5,65	5,26 ± 0,69*/ 45,57 ± 1,86 (p = 0,045)	6,04 ± 0,93/ 62,04 ± 2,7
Моноциты(10⁹/л /%)/Monocytes(10⁹/l /%)	0,63 ± 0,23/6,90 ± 1,76	1,92 ± 0,24*/9,32 ± 2,42 (p = 0,040)	1,4 ± 0,09* /9,86 ± 0,98 (p = 0,036)
Гранулоциты (10⁹/л /%)/Granulocytes (10⁹/l /%)	3,79 ± 0,42/ 35,10 ± 4,14	5,22 ± 1,03*/ 45,10 ± 2,53 (p = 0,049)	3,33 ± 0,81#/ 28,45 ± 0,50
Нейтрофилы(10⁹/л /%)/Neutrophils(10⁹/l /%)	2,62 ± 0,82/ 69,13 ± 15,2	3,33 ± 3,64*/ 63,79 ± 36,4 (p = 0,01)	0,71 ± 0,34#/ 20,1 ± 8,6 (p = 0,01#p = 0,001)
Эозинофилы (10⁹л /%)/Eosinophils(10⁹/l /%)	0,87 ± 0,08/ 22,9 ± 9,6	1,48 ± 0,29*/28,35 (p = 0,045)	1,70 ± 0,87#/ 50,15 ± 18,2 (p = 0,01;#p = 0,02)
Базофилы(10⁹л /%)/ Basophils(10⁹l /%)	0,29 ± 0,02/ 7,65 ± 1,51	0,41 ± 0,02*/ 7,86 ± 1,51 (p = 0,03)	1,0 ± 0,08#/ 30,03 ± 10,3 (p = 0,024 #p = 0,043)

Примечание: * — различия достоверны в сравнении с интактным контролем, # — различия достоверны между экспериментальными группами
Note: * — differences are significant in comparison with the intact control, # — differences are significant between experimental groups

При оценке показателей белой и красной крови между группами наблюдалась статистически значимая разница, определяемая по однофакторному анализу ANOVA для количества лейкоцитов: F(2,28) = 9,678, p = 0,001. Согласно полученным данным, лейкоцитоз присутствовал только у животных, которым в корм добавляли DL-форму препарата: в сравнении с интактным контролем количество WBC было превышено на 27,5 % (p = 0,046), тогда как во 2‑й группе их количество не изменилось. Повышение абсолютного числа гранулоцитарных форм лейкоцитов было выявлено только в экспериментальной группе № 1 (в 1,4 раза, p = 0,049), существенные различия касались их видов. Так, в 1‑й экспериментальной группе количество нейтрофилов повышалось в 1,3 раза (p = 0,049), эозинофилов в 1,7 раз (p = 0,045), базофилов в 1,4 раза (p = 0,03). Во второй экспериментальной группе было резко снижено как абсолютное (в 3,7 раза в сравнении с контрольной группой, p = 0,01), так и относительное количество нейтрофилов (см. табл. 1), 80 % гранулоцитов составляли эозинофилы и базофилы (см. табл. 1). При качественной оценке мазков крови в группе с введением L-формы метионина было отмечено появление гиперсегментированных форм нейтрофилов и незрелых форм эозинофилов (рис.).

Из агранулоцитарных форм лейкоцитов в обеих экспериментальных группах было увеличено количество моноцитов: в 3,04 раза 1‑й (p = 0,040), и в 2,22 раза (p = 0,036) во 2‑й экспериментальной группе. Изменения не касались количества лимфоцитов в группе с введением L-формы метионина.

Учитывая дисбаланс в анализах крови по гранулоцитарным формам лейкоцитов, отражающий повышенное содержание эозинофилов и базофилов, мы рассчитали индекс аллергизации организма. ИАО во 2‑й экспериментальной группе составил 10,62 ± 1,21 уе (в контроле 7,12 ± 1,02 уе), превысив, таким образом, исходный показатель на 49,2 ± 3,61 % (р = 0,01).

Отличались и показатели красной крови в экспериментальных группах (табл. 2).

Мазок крови крыс в группе с ведением L-формы метионина: а – ядра нейтрофилов содержат более 5 сегментов; б – кольцевидные ядра эозинофилов. Лейкодиф‑200. Ув. × 1000
Blood smear of rats in the group with the administration of L-form of methionine: а – Neutrophil nuclei contain more than 5 segments; b – Ring-shaped nuclei of eosinophils. Leukodif‑200. × 1000

Таблица 2 / Table 2
Показатели красной крови животных при введении DL- (1 эксперимент) и L- (2 эксперимент) форм метионина /
Red blood parameters of animals with the administration of DL (1 experiment) and L (2 experiment) forms of methionine

Показатели / Parameters	Единицы измерения / Units of measurement	Экспериментальные группы/Experimental groups
Показатели / Parameters	Единицы измерения / Units of measurement	Контроль /Control	Эксперимент 1/ Experiment 1	Эксперимент 2 / Experiment 2
Эритроциты/Red blood cells (RBC)	10¹²г/л10¹² g/l	6,75 ± 0,71	6,08 ± 0,49 (p = 0,148)	5,77 ± 1,06 (p = 0,166*, p = 0,840#)
Гемоглобин/ Hemoglobin (HGB)	г/лg/l	120,62 ± 4,13	113,17 ± 4,94 (p = 0,603)	123,9 ± 3,45 (p = 0,780*, p = 0,265#)
Гематокрит/Hematocrit (HTC)	л/лl/l	0,36 ± 0,03	0,41 ± 0,003* (p = 0,001)	0,34 ± 0,04 (p = 0,798*, p = 0,001#)
Средний размер эритроцитов/Mean Corpuscular Volume (MCV)	Фемтолитры (фл)Femtolters (fl)	54,87 ± 1,84	56,37 ± 1,52 (p = 0,993)	55,06 ± 3,31 (p = 0,912*, p = 0,943#)
Среднее содержание гемоглобина в эритроците/Mean corpuscular hemoglobin (MCH)	Пикограммы (пг)Picograms(pg)	17,72 ± 0,12	18,7 ± 0,34 (p = 0,002)	19,96 ± 0,84 (p = 0,001*, p = 0,964#)
Ширина распределе-ния эритроцитов/Red cell Distribution Width (RDW)	%	17,11 ± 0,33	17,04 ± 0,37 (p = 0,851)	14,57 ± 1,17 (p = 0,001*, p = 0,009#)

Примечания: * — различия значимы в сравнении с контрольными данными, # — различия значимы между данными экспериментальных групп.
Note: * — differences are significant in comparison with the intact control, # — differences are significant between experimental groups.

Статистически значимые изменения в показателях красной крови отмечались в группе животных с введением L-формы метионина. У крыс этой группы изменились: количество эритроцитов (было снижено на 14,5 ± 3,5 %), средняя ширина эритроцитов — показатель RDW — достоверно снижалась на 14,8 % ± 4,94, (p = 0,001); гемоглобин (HGB) не изменялся, однако его концентрация в одном эритроците (MCH) достоверно повышалась на 12,6 ± 2,88 % (p = 0,002).

Скорость оседания эритроцитов составила: 2,0 ± 0,01 мм/ч в контрольной и 2,1 ± 0,11 мм/ч (p = 0,943) в 1‑й экспериментальной группе. Во 2‑й группе СОЭ была повышена до 2,38 ± 0,32 (p = 0,915).

К функциональным показателям гемопоэза относится НЭК — нагрузочный эритроцитарный коэффициент. Для интактных крыс в возрасте 2‑х месяцев этот показатель составил 16,6 ± 0,3 %; 18,6 ± 0,5 % (повышение составило 12,0 %, р>0,05) в 1‑й, и 19,2 ± 0,3 % во 2‑й экспериментальных группах (повышение составило 15,7 % (p = 0,043).

Противоположными по направлению изменений оказались показатели количества тромбоцитов в группах с введением различных изомеров метионина. Так, если в 1‑й экспериментальной группе количество тромбоцитов превышало исходные показатели на 19,14 % (в интактном контроле 660,75 ± 93,18 × 10⁹л vs в 1 эксперименте 787,25 ± 68,74 × 10⁹л), тогда как во при введении L-формы метионина их количество было достоверно снижено на 37,03 % (416,08 ± 59,52 × 10⁹л). Согласно однофакторному анализу ANOVA наблюдалась статистически значимая разница в количестве тромбоцитов: F(2,28) = 8,442, p = 0,002.

Таким образом, были выявлены отличия в показателях крови экспериментальных животных, которые содержались на «диете» с добавками различных изоформ метионина — DL- и L-вариантов.

Неодинаковый биологический эффект действия изомеров химических веществ — явление известное [10, 11]. Аминокислота метионин существует в форме правых и левых изомеров (энантиомеров, таутомеров), отличающихся по наличию их в организме, активности действия, биологическим эффектам. В природе аминокислота представлена преимущественно левовращающей L-формой. В нашем исследовании метионин использовался как пищевая биодобавка, в результате переизбытка которого у животных формируется гиперГЦ. Однако, если в первом эксперименте прикорм, добавляемый животным, состоял из смеси в равных количествах D- (50 %) и L-форм (50 %) (кормовая добавка DL-метионин 99 %, Бельгия), то во втором — только L-форму аминокислоты (производитель Fingres Biotech INC, Китай). Эксперименты по оценке биодоступности и эффективности изомеров метионина показали одинаковую их биодоступность [12]. Классически считается, что в организме биологически активны левые L-аминокислоты. Однако в последние годы появляется все больше работ, свидетельствующих о многогранной роли правых D-изомеров аминокислот. Их рассматривают в качестве регуляторов физиологических функций организмов [13, 17], предлагают в качестве биомаркеров заболеваний [18], учитывают в прогнозировании и терапевтических вмешательствах, используя анализ хирального метаболического профилирования [19].

Важным показателем, отражающим различный биологический эффект действия изомеров различных форм метионина, является неодинаковая концентрация в крови гомоцистеина. В проведенных раннее экспериментах было показано, что при введении DL-формы метионина в течение 8–12‑и недель [6] концентрация гомоцистеина плавно увеличивалась, но не превышала 28–30 мкмоль/л. В то же время, использование 100 % L-формы привело к умеренно-высоким значениям гомоцистеина (79,38 ± 3,91 мкмоль/л) уже в течение трех первых недель использования его в качестве добавления к корму.

Значимые различия в ответной реакции организма на введение либо рацемической смеси энантиомеров, либо чистого L-метионина в прикорм животным складываются из изменений в количестве, процентном состоянии, качественной характеристике клеток белой и красной крови. Основная направленность изменений — аллергическая настроенность организма характерна для обеих групп животных и проявляется в повышении числа иммунных клеток крови (эозинофилов и базофилов), увеличении ИАО, моноцитозе, но в разной степени выраженности. Лейкоцитоз с незначительным нейтрофилезом присутствовал только у животных первой группы, тогда как у крыс 2 группы наблюдалась умеренная нейтропения. Эффект сниженной функциональной активности при воздействии высоких доз гомоцистеина отмечен и в культуре клеток [20]. Появление в крови гиперсегментированных форм нейтрофилов может быть обусловлено различными причинами, включающими дефицит фолиевой кислоты и витамина В12, витамина А, дефектами липидного обмена [21]. Основной механизм, вызывающий гиперсегментацию, по-видимому, заключается как в сбоях в синтезе ДНК, так и в ее повреждении, потере структурной целостности ядра [22], что вполне согласуется с ролью метионина в организме, в частности, обеспечении метилирования ДНК.

Изменяются и показатели красной крови, что сопровождается повышением нагрузочного эритроцитарного коэффициента, отражающего функциональную нагрузку на гемопоэз. Эти изменения также наиболее выражены у животных второй экспериментальной группы с введением L-метионина, но не первой (DL-изомеры аминокислоты). Анализ морфологических особенностей эритроцитов считается прогностически значимым при сердечно-сосудистых заболеваниях [23].

Нельзя исключать возможность того, что в экспериментальных исследованиях [24], в которых использовался пищевой метионин, индуцирующий гипергомоцистеинемию, наблюдаемые поражения могли быть вызваны негативным эффектом, связанным с избыточным потреблением именно метионина, а не только и не столько повышенным уровнем гомоцистеина в крови per se.

Заключение

Таким образом, выраженность гипергомоцистеинемии, направленность ответных реакций белой и красной крови, коэффициентов, отражающих аллергическую настроенность организма и функциональную эритроцитарную нагрузку при избыточном введении метионина в качестве биодобавки, определяются формой изомера, входящего в ее состав.