Уровень копийности митохондриальной ДНК в культуральной среде эмбрионов человека как фактор прогноза наступления и пролонгирования беременности

Полный текст

Введение

Главной задачей лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) является помощь в наступлении беременности и рождении здорового ребенка [1, 2]. Качество эмбриона, переносимого в полость матки, является одним из важнейших факторов, влияющих на успех проводимой программы. В качестве косвенных показателей имплантационного потенциала эмбрионов в клинической практике оценивают качество эмбрионов по морфологии и их хромосомный статус (эуплоидный/анеуплоидный). Однако отличное качество эмбрионов по морфологии не исключает наличия у них анеуплоидий, а для проведения генетического анализа (преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии (ПГТ-А)) всегда требуется инвазивное вмешательство (наиболее часто — биопсия трофэктодермы), требующее дополнительных временных и технических затрат, и, возможно, отрицательно влияющее на имплантационные возможности эмбриона. Более того, отбор только эуплоидных эмбрионов отличного качества также не гарантирует успешный исход программы ВРТ. Учитывая вышесказанное, особую актуальность в настоящее время приобретает поиск новых неинвазивных подходов к селекции эмбрионов с наивысшим имплантационным потенциалом.

Так, в качестве одной из возможных дополнительных методик исследователи изучают внеклеточную мтДНК в отработанной культуральной среде (ОКС). Известно, что митохондрии в клетке ответственны за производство энергии, принимают участие в поддержании кальциевого гомеостаза, процессах окисления жирных кислот и апоптозе [3]. Предполагается, что уровень мтДНК может отражать энергетическую нагрузку, уровень окислительного стресса, а также компенсаторные возможности клеток. Цель исследования — изучить возможность использования количественной оценки уровня геномной (гДНК), митохондриальной ДНК (мтДНК) в отработанной культуральной среде (ОКС) и мтДНК в трофэктодерме (ТФЭ) как маркёра успешной имплантации и продолжающейся более 12 недель беременности.

Материалы и методы

Проанализировано 195 образцов отработанных культуральных сред (ОКС) от 93 супружеских пар с бесплодием, обратившихся для проведения цикла ВРТ с ПГТ-А в период с января 2023 года по март 2024 года. Исследование одобрено Этическим Комитетом при ФГБУ «НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава РФ от 28.10.2021 года. Протокол № 10. Пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.

В качестве лабораторного контроля использовали 16 образцов культуральной среды, находящихся в аналогичных условиях культивирования, но не содержащие эмбрионы. Все образцы культуральной среды подвергались криоконсервации после сбора.

Овариальная стимуляция, трансвагинальная пункция яичников проводились по стандартной методике. Оплодотворение ооцитов во всех случаях осуществляли методом интрацитоплазматической инъекции в сперматозоид (ИКСИ) [4]. Все этапы культивирования эмбрионов и морфологическая оценка бластоцист, а также сбор ОКС проводились по ранее описанной методике [4]. В исследование включены образцы ОКС бластоцист, которым была выполнена биопсия трофэктодермы (ТФЭ) и преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии по ранее описанной методике [5].

По результатам ПГТ-А через несколько менструальных циклов 43 пациенткам был выполнен перенос одного размороженного эуплоидного эмбриона (ПРЭ) в полость матки. ПРЭ и ведение посттрансферного периода осуществлялось согласно принятым в клинической практике протоколам.

В зависимости от исхода ПРЭ пациенты были разделены на группы: группа 1 — пациентки, у которых беременность наступила и продолжалась > 12 недель гестации (n=18), группа 2 — пациентки, у которых беременность не наступила или прервалась до 12 недель гестации (n=25). В сравниваемых группах были проанализированы клинико-­анамнестические данные, особенности фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза.

Дополнительно все бластоцисты были стратифицированы на группы по наличию анеуплоидии (n=195): группа 1.1. — эуплоидные бластоцисты (n=98), группа 2.1. — анеуплоидные бластоцисты (n=97).

Для всех 195 полученных бластоцист была выполнена оценка уровня копийности мтДНК в клетках ТФЭ и уровня копийности гДНК и мтДНК в ОКС.

Оценка уровня копийности мтДНК в трофэктодерме

Определение уровня копийности мтДНК в клетках ТФЭ осуществлялось путем нормировки на аутосомы согласно программному обеспечению SeqVario. Долю мтДНК в ТФЭ исчисляли в относительных единицах (о. е.). Расчет значения определяли путем отношения ридов, выровненных на митохондрию, к количеству всех ридов, выровненных на геном (все хромосомы и митохондрии).

Оценка уровня копийности мтДНК и гДНК в отработанной культуральной среде

Определение уровня копийности гДНК и мтДНК в ОКС осуществляли с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Реакцию проводили одновременно с двумя наборами праймеров на всем объеме (25 мкл) полученной культуральной среды. Подсчет копий мтДНК проводили по ранее описанной методике [4].

Оценка уровня гДНК проводиласть в геномных единицах. Стандарты были приготовлены из лейкоцитов человека. Концентрация ДНК стандарта была установлена на флуориметре qubit 3.0. Для проведения ПЦР использовали амплификатор CFX96 («Bio Rad», USA). Температурный профиль реакции: 95 °C 5 мин; 40 циклов: 95 °C 10 с., 60 °C 30 с. Использованные праймеры представлены в табл. 1. Праймеры были подобраны с помощью программного обеспечения Lasergene-­Software (DNASTAR, Madison, Wisconsin, USA) выбор происходил исходя из максимальной эффективности ПЦР, праймеры были проверены на отсутствие альтернативных продуктов при помощи веб-сервера BiSearch [6]. Полученные данные флюоресценции были пересчитаны в абсолютное количество копий с помощью программного обеспечения амплификатора CFX96 BioRad.

Таблица 1 / Table 1
Последовательности праймеров и зондов /
Sequences of primers and probes

Ген / Gene	Последовательность / Sequence	Праймер / Зонд / Primer/ Probe
CHR١	CACAGACTGCCTGGAATC	Праймер прямой / Forward primer
	TCCATCTGTCTGTGAAGTGA	Праймер обратный / Reverse primer
	(ROX)ATCTCTAGAAAACTTCTAGAAGAGCTTCA(BHQ٢)	Зонд / Probe
MITH	CCACATCTACCATCACCCTC	Праймер прямой / Forward primer
	TAGAATAAATAGGAGGCCTAGGTT	Праймер обратный / Reverse primer
	(R٦G)ATCACCGCCCCGACCTTAGCTCTCA(BHQ٢)	Зонд / Probe

Статистическая обработка данных

Статистический анализ проводился в программе Jamovi. Для описания категориальных бинарных данных использовали абсолютные значения и процентные доли от общего числа в группе. Анализ качественных признаков проводили с помощью χ² Пирсона. Для сравнения бинарных данных мерой сравнения явилось ОШ с 95 % доверительным интервалом (95 % ДИ). Метод логистической регрессии использовался при расчете ОШ_кор для контроля конфаундеров. Непрерывные переменные были представлены в виде медианы и межквартильных значений (Ме(Q1-Q3)). С целью определения статистической значимости различий непараметрических данных был выбран критерий Манна – Уитни. При проведении ROC-анализа рассчитывали порог отсечки, площадь под ROC-кривой (AUC), рассчитывали чувствительность (Se) и специфичность (Sp) модели. Величину порогового уровня значимости p принимал и равной 0,05.

Результаты и обсуждение

В исследование включено 211 образцов культуральной среды: 195 образцов, содержащих эмбрион, от 93 супружеских пар, и 16 образцов — в качестве контроля.

Клиническая характеристика пациенток, которым был выполнен перенос размороженного эмбриона

После ПРЭ беременность наступила у 22 пациенток, но у 4 из них произошел самопроизвольный выкидыш до 12 недель беременности, поэтому основную группу 1 составили 18 пациенток с продолжающейся >12 недель беременностью, группу сравнения 2–25 пациенток с не наступившей или прервавшейся беременностью. Характеристики групп пациенток представлены в табл. 2. Пациентки группы 1 отличались от пациенток группы 2 тем, что у них было меньше абортов и более длительный период бесплодия в анамнезе, а также в 3 раза чаще выявлялась миома матки. Также в группе 1 в 2,8 раз чаще производился перенос эмбриона отличного качества.

Таблица 2 / Table 2
Характеристики пациенток, которым был выполнен ПРЭ, в зависимости от наступления и пролонгирования беременности после ВРТ (n=43) / 
Characteristics of patients who underwent FET depending on the onset and prolongation of pregnancy after ART (n=43)

Параметр / Parameter	Группа 1 (беременность+) n=18 / Group 1 (pregnancy+)  n=18	Группа 2 (беременность-) n=25 / Group 2 (pregnancy-)  n=25	р
Возраст, антропометрические данные, вредные привычки / Age, anthropometric data, bad habits
Возраст** / Age**	35 (31–37)	36 (34–41)	0,14
ИМТ** / BMI**	22 (20,3–23)	21 (20–24)	0,38
Менструальный цикл и репродуктивная функция / Menstrual cycle and reproductive function
Число беременностей*** / Number of pregnancies***	0 (0–4)	0 (0–6)	0,12
Число родов*** / Number of births***	0 (0–2)	0 (0–3)	0,28
Число абортов*** / Number of abortions***	0 (0–0)	0 (0–3)	0,03
Анамнез гинекологических заболеваний / History of gynecologic diseases
Заболевания шейки матки* / Cervical diseases*	4 (22,2 %)	9 (36 %)	0,33
Аденомиоз и/или НГЭ* / Adenomyosis and/or EGE*	6 (33,3 %)	8 (32 %)	0,93
Миома матки* / Uterine myoma*	7 (38,9 %)	3 (12 %)	0,04
Полип эндометрия* / Endometrial polyp*	6 (33,3 %)	10 (40 %)	0,65
СПКЯ* / PCOS*	1 (5,6 %)	0	0,23
Анамнез гинекологических оперативных вмешательств / History of gynecologic surgical procedures
Тубэктомия* / Tubectomy*	2 (11,1 %)	4 (16 %)	0,65
Гистероскопия* / Hysteroscopy*	12 (66,7 %)	11 (44 %)	0,14
Оперативные вмешательства на яичниках* / Ovarian surgery*	5 (27,8 %)	2 (8 %)	0,08
Анамнез заболевания на момент цикла овариальной стимуляции / Medical history at the time of the ovarian stimulation cycle
Первичное бесплодие* / Primary infertility*	10 (55,6 %)	10 (40 %)	0,31
Длительность бесплодия, лет** / Duration of infertility, years**	5 (3,5–8,7)	2 (1–5)	0,04
Уровень АМГ, нг/мл** / AMH level, ng/mL**	1,4 (0,8–3,2)	2,1 (1,5–3,6)	0,47
Характеристики протокола овариальной стимуляции / Characteristics of the ovarian stimulation protocol
Номер попытки ЭКО** / IVF number**	3 (1–5)	2 (1–4)	0,36
Длительность стимуляции, дней** / Duration of ovarian stimulation, days**	10 (9–11)	10 (9–11)	0,90
Суммарная доза гонадотропинов, МЕ** / Total dose of gonadotropins, IU**	1800 (1500–2156)	1650 (1500–2400)	0,88
Характеристики эмбриологического этапа цикла овариальной стимуляции /  Characteristics of the embryologic stage of the ovarian stimulation cycle
Число зрелых ооцитов** / Number of mature oocytes**	6 (3–12)	6 (5–11)	0,71
Число зигот** / Number of zygotes**	5 (3–10)	6 (4–11)	0,48
Характеристики эмбрионов / Characteristics of embryos
Экспансия бластоцисты на 5-е сутки* / Blastocyst expansion on the 5th day*	13 (72,2 %)	15 (60 %)	0,41
Перенос бластоцисты отличного качества* / Transfer of excellent quality blastocyst *	8 (44,4 %)	4 (16 %)	0,04

Примечание: абс (%), χ2-тест, ** Mе (Q25-Q75), *** Me (min-max), тест Манна – Уитни, cтатистически значимые отличия группы 1 от группы 2 (p≤0,05); ИМТ — индекс массы тела, НГЭ — наружный генитальный эндометриоз, СПКЯ — сидром поликистозных яичников, АМГ — антимюллеров гормон.
Note: *abs (%), χ2 test, ** Me (Q25-Q75), *** Me (min-max), Mann – Whitney test, significant differences between group 1 and group 2 (p≤0.05); BMI — body mass index, EGE — external genital endometriosis, PCOS — polycystic ovary syndrome, AMH — anti-müllerian hormone.

Сравнение клинических исходов, уровня копийности мтДНК в клетках трофэктодермы, гДНК и мтДНК в отработанной культуральной среде эмбрионов после переноса размороженного эмбриона.

На первом этапе выполнили анализ уровня ДНК в ОКС в сравнении с контрольными каплями (которые находились в тех же условиях культивирования, но не содержали эмбрион) (табл. 3).

Таблица 3 / Table 3
Уровень копийности гДНК и мтДНК в ОКС в каплях, содержащих эмбрион, и контрольных каплях /
Copy number levels of gDNA and mtDNA in SCM in embryo-­containing droplets and control droplets

Параметр / Parameter	Эмбрионы n=195 / Embryos n=195	Контрольные капли n=16 /  Control drops n=16	р
мтДНК в ОКС / mtDNA in SCM	134 (50,0–256)	32,2 (10,6–63,9)	<0,001
мтДНК/гДНК / mtDNA/gDNA	11,4 (6,47–26,1)	2,52 (1,36–7,92)	<0,001

Примечание: Mе(Q25-Q75), тест Манна – Уитни, cтатистически значимые отличия между группами (p≤0,05); ОКС — отработанная культуральная среда, мтДНК — митохондриальная ДНК, гДНК — геномная ДНК
Note: Me(Q25-Q75), Mann – Whitney test, significant differences between groups (p≤0.05); SCM — spent culture medium, mtDNA — mitochondrial DNA, gDNA — genomic DNA

Уровень копийности мтДНК и мтДНК/гДНК в ОКС был статистически значимо выше, чем в контрольных каплях. Учитывая, что мтДНК и гДНК в ОКС была также детектирована в контрольных каплях, следует предположить возможность некоторой контаминации на эмбриологическом или лабораторном этапах. Возможные причины контаминации и методы ее профилактики обсуждены в предыдущих исследованиях [4].

Далее уровень копийности мтДНК в клетках ТФЭ, гДНК и мтДНК в ОКС эмбрионов был проанализирован в зависимости от факта продолжающейся клинической беременности >12 недель — в группах 1 и 2 (табл. 4).

Таблица 4 / Table 4
Уровень копийности гДНК, мтДНК, мтДНК/гДНК в ОКС, мтДНК в ТФЭ в зависимости от продолжающейся >12 недель беременности после ПРЭ /
Copy number levels of gDNA, mtDNA, mtDNA/gDNA in SCM, and mtDNA in TE as a function of continued >12 weeks gestation after FET

Параметр / Parameter	Группа 1 n=18 / Group 1 n=18	Группа 2 n=25 / Group 2 n=25	р
мтДНК в ТФЭ (о. е.) / mtDNA in TE (relative units)	0,002 (0,002–0,003)	0,002 (0,001–0,003)	0,43
гДНК в ОКС (число копий) / gDNA in SCM (copy number)	4,1 (3,5–6,6)	9,0 (6,3–17,8)	0,01
мтДНК в ОКС (число копий) / mtDNA in SCM (copy number)	49,3 (20,7–126)	264 (154–382)	0,007
мтДНК/гДНК в ОКС / mtDNA/gDNA in SCM	8,6 (5,4–27,5)	17,2 (9,9–55,4)	0,09

Примечание: Mе(Q25-Q75), тест Манна – Уитни, cтатистически значимые отличия между группами (p≤0,05); ТФЭ — трофэктодерма, ОКС — отработанная культуральная среда, мтДНК — митохондриальная ДНК, гДНК — геномная ДНК
Note: Me(Q25-Q75), Mann – Whitney test, significant differences between groups (p≤0.05); TE — trophectoderm, SCM — spent culture medium, mtDNA — mitochondrial DNA, gDNA — genomic DNA

Уровень копийности мтДНК и гДНК в ОКС был статистически значимо ниже в группе 1 (продолжающаяся беременность >12 недель) по сравнению с группой 2. Отличий в уровне копийности мтДНК в ТФЭ выявлено не было.

Был проведен многофакторный анализ для оценки ОШ_кор продолжающейся беременности > 12 недель после переноса эуплоидного эмбриона с учетом выявленных конфаундеров: число абортов в анамнезе, длительность бесплодия и частота миомы матки, качество переносимого эмбриона. Были созданы модели прогноза продолжающейся беременности, в которой статистической значимостью обладали следующие факторы: мтДНК и гДНК в ОКС и качество переносимого эмбриона.

Для каждой количественной величины (мтДНК в ОКС, гДНК в ОКС) был найден порог отсечки: для мтДНК в ОКС он составил 95 копий (Se=66,7 %, Sp=80 %, AUC=73 %, р=0,008), для гДНК в ОКС — 5 копий (Se=58 %, Sp=85 %, AUC=71 %, р=0,01). ОШ_кор наступления и пролонгирования беременности при уровне мтДНК в ОКС <95 копий с учетом указанных конфаундеров составил 3,2 (95 % ДИ=1,1–31,6).

Была получена следующая формула прогноза вероятности продолжающейся беременности после ПРЭ с включением количественных показателей (Se модели составила 67,0 %, Sp — 91 %, площадь под кривой (AUC) — 90,0 %) (формула (1), рис. 1).

\( Р(ПБ) =({\frac{ Exp [0,52-0,002* mtDNA -0,16* gDNA +2,0*Кач]}{1+ Exp [0,52-0,002* mtDNA -0,16* gDNA +2,0*Кач]}}) *100 % \)                                 (1)

где Р(ПБ) — вероятность продолжающейся беременности после ПРЭ; Exp — экспонента; мтДНК — копийность мтДНК в ОКС; гДНК — копийность гДНК в ОКС; Кач — перенос бластоцисты отличного качества

\( Р(PB) =({\frac{ Exp [0,52–0,002*мтДНК –0,16*гДНК+2,0* quality] }{1+ Exp [0,52–0,002*мтДНК –0,16*гДНК+2,0* quality]}}) *100 % \)                          (1)

where P(PB) is the probability of continued pregnancy after FET; Exp — exponent; mtDNA — mtDNA copy number in SCM; gDNA — gDNA copy number in SCM; quality — transfer of excellent quality blastocyst

Кроме того, была получена следующая формула прогноза вероятности продолжающейся беременности после ПРЭ с включением бинарных показателей (Se модели составила 75,0 %, Sp — 70 %, площадь под кривой (AUC) — 83,8 %) (формула (2)).

\( Р(ПБ) =({\frac{ Exp [-1,14+1,5*мтДНК<95+2,4*гДНК<5+1,2*Кач]}{1+ Exp [-1,14+1,5*мтДНК<95+2,4*гДНК<5+1,2*Кач]}}) *100 % \)                           (2)

где Р(ПБ) — вероятность продолжающейся беременности после ПРЭ; Exp — экспонента; мтДНК — копийность мтДНК в ОКС; гДНК — копийность гДНК в ОКС; Кач — перенос бластоцисты отличного качества

\( Р(ПБ) =({\frac{ Exp [-1,14+1,5* mtDNA <95+2,4* gDNA <5+1,2* quality]}{1+ Exp [-1,14+1,5* mtDNA <95+2,4* gDNA <5+1,2* quality]}}) *100 % \)                         (2)

where P(PB) is the probability of continued pregnancy after FET; Exp — exponent; mtDNA — mtDNA copy number in SCM; gDNA — gDNA copy number in SCM; quality — transfer of excellent quality blastocyst

Рис. 1. ROC-кривая для модели оценки вероятности продолжающейся беременности (>12 недель) после переноса эуплоидного эмбриона в зависимости от уровня копийности мтДНК и гДНК в ОКС
Fig. 1. ROC curve for a model to estimate the probability of ongoing pregnancy (>12 weeks) after euploid embryo transfer as a function of mtDNA and gDNA copy number levels in SCM

Дополнительно был проанализирован уровень копийности мтДНК в клетках ТФЭ, гДНК и мтДНК в ОКС эмбрионов в зависимости от плоидности бластоцист — в группах 1.1. и 2.1. (табл. 5). Не было выявлено каких-либо отличий в сравниваемых группах.

В представленной работе изучалась зависимость между характеристиками пациенток, хромосомным статусом эмбрионов и уровнем гДНК и мтДНК в ОКС, а также уровнем мтДНК в ТФЭ. В качестве контроля использовался уровень мтДНК в образцах культуральной среды, не содержащей эмбрионы и находившейся в тех же условиях.

Таблица 5 / Table 5
Уровень копийности гДНК и мтДНК в ОКС, мтДНК в ТФЭ в зависимости от плоидности бластоцист по результатам ПГТ-А /
Copy number levels of gDNA and mtDNA in SCM, mtDNA in TE depending on the ploidy of blastocysts according to PGT-A results

Параметр / Parameter	Группа 1.1. (эуплоидные эмбрионы) n=98 / Group 1.1 (euploid embryos) n=98	Группа 1.2 (анеуплоидные эмбрионы) n=97 / Group 1.2 (aneuploid embryos) n=97	р
мтДНК в ТФЭ (о. е.) / mtDNA in TE (relative units)	0,002 (0,002–0,003)	0,002 (0,001–0,003)	0,87
гДНК в ОКС (число копий) / gDNA in SCM (copy number)	8,3 (5,2–16,6)	10,0 (4,8–18,4)	0,99
мтДНК в ОКС (число копий) / mtDNA in SCM (copy number)	148 (53,5–259)	113 (42,0–253)	0,62
мтДНК/гДНК в ОКС / mtDNA/gDNA in SCM	11,6 (6,6–28,3)	11,3 (6,0–21,3)	0,59

Примечание: Mе(Q25-Q75), тест Манна – Уитни, cтатистически значимые отличия между группами (p≤0,05); ТФЭ — трофэктодерма, ОКС — отработанная культуральная среда, мтДНК — митохондриальная ДНК, гДНК — геномная ДНК
Note: Me(Q25-Q75), Mann – Whitney test, significant differences between groups (p≤0.05); TE — trophectoderm, SCM — spent culture medium, mtDNA — mitochondrial DNA, gDNA — genomic DNA

В представленной работе изучалась зависимость между характеристиками пациенток, хромосомным статусом эмбрионов и уровнем гДНК и мтДНК в ОКС, а также уровнем мтДНК в ТФЭ. В качестве контроля использовался уровень мтДНК в образцах культуральной среды, не содержащей эмбрионы и находившейся в тех же условиях.

Согласно полученным результатам уровень копийности мтДНК и гДНК в ОКС был статистически значимо ниже в группе с продолжающейся беременностью > 12 недель по сравнению с группой без наступления беременности или ее прерыванием в первом триместре. При уровне мтДНК в ОКС < 95 копий шансы наступления и сохранения беременности повышались в 3,2 раза.

Некоторые исследователи также изучали вопрос возможной предикции исхода переноса эмбриона в зависимости от уровня мтДНК в ОКС и/или уровня мтДНК в ТФЭ. По одним данным, повышенный уровень мтДНК в ОКС эмбрионов ассоциирован с успешным исходом переноса и наступившей беременностью [7, 8]. По другим данным, связь между уровнем мтДНК в ОКС и частотой клинической беременности не была найдена [4, 9].

Кроме того, согласно результатам работы, отличий в уровне копийности мтДНК в ТФЭ выявлено не было. Полученные нами данные согласуются с рядом научных работ, представивших аналогичные выводы [5, 10–12]. Однако, согласно данным литературы, другие ученые показали повышенный потенциал к имплантации и успешной беременности для эмбрионов со сниженным уровнем мтДНК в клетках ТФЭ [3, 13–16].

В приведенной работе дополнительно изучалась зависимость между уровнем мтДНК и гДНК в ОКС, а также мтДНК в ТФЭ с учетом наличия анеуплоидий у эмбрионов. Значимых отличий нами не обнаружено, что согласуется с результатами других исследователей, получивших аналогичные данные [9, 11, 17]. В литературе также обсуждается взаимосвязь между уровнем мтДНК в ТФЭ и хромосомным статусом эмбрионов. Так, одни авторы показали повышение уровня мтДНК в ТФЭ анеуплоидных эмбрионов, в сравнении с эуплоидными [18]. В то же время, другие ученые статистически значимой разницы не обнаружили [11].

Массив работ, представленных к настоящему времени в мировой литературе, представляет разнящиеся, часто противоположные данные о зависимости уровня гДНК и мтДНК в ОКС и качестве эмбрионов. Большинство работ включают небольшие выборки пациентов и не оценивают их репродуктивные исходы.

Кроме того, подобная широкая вариабельность результатов может быть связана с особенностями работы митохондрий в разные фазы деления эмбрионов. Так, с самого начала развития эмбриона функция указанных органелл зависит именно от митохондрий, привнесенных ооцитом [3, 19–21]. Далее, следует отметить, что согласно теории «горлышка от бутылки» («mtDNA bottleneck theory»), в первые дни развития эмбриона общее количество митохондрий зиготы разделяется между клетками эмбриона при делении, а собственная репликация митохондриальной ДНК активируется к 3 суткам развития и значительно усиливается к 5 суткам [8, 19–21].

Теория «тихого эмбриона» представляет меньшее количество мтДНК в клетках ТФЭ бластоцист отличного и хорошего качества, находящихся в оптимальных условиях, не требующих повышения интенсивности энергетического метаболизма для борьбы со «стрессом» [3, 5, 19]. Однако каким именно образом происходит распределение мтДНК в клетках эмбриона (для внутренней клеточной массы и ТФЭ) и выделение внеклеточной ДНК в ОКС, остается неизвестным. Исследований, одновременно оценивающих соотношение уровня гДНК и мтДНК в клетках эмбриона и ОКС в зависимости от его качества или потенциала к имплантации, в настоящее время в литературе не представлено. В то же время, согласно полученным в настоящей работе результатам, повышенный уровень мтДНК в клетках ТФЭ и сниженный уровень мтДНК в ОКС отмечался у эмбрионов с более высоким потенциалом к имплантации и продолжающейся беременности. Представленные данные не противоречат описанным выше теориям и согласуются с представлениями о том, что сбалансированное достаточное функционирование митохондрий в клетках эмбриона сопряжено с повышенным содержанием мтДНК в ТФЭ и, соответственно, со сниженным количеством мтДНК в ОКС. И, противоположно, для эмбрионов со сниженным потенциалом к продолжающейся беременности, нарушенная функция митохондрий в клетках и «энергетический стресс» приводят к снижению мтДНК в ТФЭ и, возможно, повреждению клеток и выходу мтДНК в ОКС, повышая ее концентрацию.

Выводы

Несмотря на то, что ВРТ интенсивно развиваются и появляются новые эмбриологические методики с целью повышения эффективности лечения бесплодия, не менее половины циклов ЭКО заканчиваются неудачным исходом. В ходе настоящей работы было показано, что уровень копийности гДНК и мтДНК в ОКС является значимым прогностическим фактором наступления и пролонгирования беременности. Так, более низкие показатели уровня мтДНК в ОКС связаны с повышением вероятности наступления и пролонгирования беременности > 12 недель. По результатам проведенного исследования предложена формула расчета вероятности успешного исхода переноса эмбриона по уровню внеклеточной ДНК в ОКС, позволяющая производить отбор лучших эмбрионов для переноса в полость матки для увеличения эффективности лечения бесплодия методам ВРТ и снижения репродуктивных потерь.

Об авторах

О. И. Лисицына

Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: o_yazykova@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-7775-3508
SPIN-код: 5211-4258
г. Москва, Российская Федерация

Н. П. Макарова

Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: o_yazykova@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-1396-7272
SPIN-код: 8498-4890
г. Москва, Российская Федерация

А. М. Красный

Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: o_yazykova@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-7883-2702
SPIN-код: 3949-3450
г. Москва, Российская Федерация

А. Н. Екимов

Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: o_yazykova@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-5029-0462
SPIN-код: 7491-7303
г. Москва, Российская Федерация

А. Ю. Романов

Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: o_yazykova@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-1821-8684
SPIN-код: 6068-4561
г. Москва, Российская Федерация

Н. В. Долгушина

Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: o_yazykova@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-1116-138X
SPIN-код: 1725-9876
г. Москва, Российская Федерация

Список литературы

Дополнительные файлы