SELECTION OF GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID PRODUCING LACTOBACILLUS AND BIFIDOBACTERIUM SYMBIONT STRAINS AS POTENTIAL PSYCHOBIOTICS

Full Text

Стрессы при продолжительном воздействии на организм человека приводят к развитию ряда неврологических заболеваний, в частности депрессии и тревож- ным расстройствам [16]. Экологические стрессоры (низкие температуры, изме- нение фотопериодизма, магнитного поля и излучения), характерные для Край- него Севера, являются одной из причин развития у человека так называемого синдрома полярного напряжения. Это состояние характеризуется глубокими на- рушениями процессов на клеточном уровне и выражается утомляемостью, на- рушением сна, депрессией, тревожным состоянием и др. Депрессивное состояние сопровождается рядом физиологических изменений: активизацией вегетативной нервной системы, изменением гормонального статуса, активизацией гипотала- мо-гипофизарно-адреналовой системы, изменениями в составе кишечной микро- биоты, увеличением количества адреналина, снижением активности ГАМК- рецепторов, снижением количества инсулина в крови [1].51Вестник РУДН, серия Экология и безопасность жизнедеятельности, 2016, № 4Применение лекарств-антидепрессантов, несмотря на их эффективность, име- ет ряд недостатков: эффект привыкания, побочные эффекты. Поиск новых ле- карственных средств крайне важен. Такими принципиально новыми лекарствен- ными средствами являются пробиотические бактерии, преимущественно лакто- бациллы и бифидобактерии, в достаточных количествах способные оказывать благоприятное воздействие на здоровье пациентов. Пробиотики все чаще ис- пользуются в комбинированном лечении начальных стадий различных сомати- ческих заболеваний [2]. Преимуществом использования пробиотиков в качестве лекарственных средств является их относительная безвредность и физиологич- ность по сравнению с химическими препаратами.Совокупность населяющих тело человека микроорганизмов (преимуществен- но бактерий) - микробиом (микробиота) - играет чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности организма [18]. Бактерии кишечного микробиома участвуют не только в регуляции общего метаболизма и иммунитета, но и в функциониро- вании нервной системы хозяина [5; 14]. Кишечный микробиом рассматривается в настоящее время как часть так называемой оси «кишечник - мозг (gut - brain axis)» - двунаправленной коммуникационной системы, обеспечивающей слож- ное функционирование ЦНС и ЖКТ [9; 10]. Отдельные штаммы пробиотических бактерий способны положительно влиять на эмоциональное поведение, воспри- ятие боли, стресса у лабораторных животных [4]. Есть данные о подобном действии пробиотиков, так называемых психобиотиков на людей [8; 13; 15]. Взаимодей- ствие бактерий кишечной микробиоты и нервной системы организма-хозяина осуществляется посредством синтезируемых бактериями низкомолекулярных веществ, нейромедиаторов и гормоноподобных веществ; к ним относятся аце- тилхолин и другие холины, серотонин, норадреналин, гистамин и другие амины, жирные кислоты с короткими цепями, гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) [10]. Секретируемые бактериями нейротрансмиттеры могут непосредственно дей- ствовать на нервные окончания в ЖКТ, а также стимулировать эпителиальные клетки кишечника, которые в ответ высвобождают молекулы, модулирующие нейропередачу в энтеральной нервной системе, оказывая влияние на мозг и по- ведение человека. Такого рода бактерии следует рассматривать как систему до- ставки нейроактивных соединений в нужное место (клетки энтеральной нервной системы), обладающую профилактическим и терапевтическим потенциалом в отношении неврологических и нейрофизиологических расстройств.Материалы и методыШтаммы бактерий и условия культивирования. В работе были использованы 114 штаммов 16 видов лактобацилл и бифидобактерий, выделенных из фекалий, слюны и вагинального содержимого жителей центрального региона РФ, а также 3 штамма из коллекции ATCC. Лактобациллы и бифидобактерии выращивали в жидкой и на агаризованной среде MRS [6] при 37 °С в течение 24-48 час. в ана- эробных условиях, обеспечивающих атмосферу, содержащую 10% СО2 (HiAnaerobic System - Mark III, HiMedia, India). Для бифидобактерий в среду добавляли 0,05% цистеина. При проверке способности штаммов к синтезу ГАМК в среду добав-52Юнес Р.А., Полуэктова Е.У., Дьячкова М.С. и др. Отбор бактерий-симбионтов рода Lactobacillus...ляли 1% предшественника ГАМК мононатриевой соли глютаминовой кислоты. PLP добавляли в MRS в концентрации 0,5 мМ.Тонкослойная хроматография и определение количества ГАМК. Для разделения аминокислот в культуральной жидкости штаммов и идентификации ГАМК про- водили тонкослойную хроматографию на стеклянных пластинах со слоем сили- кагеля (TLC plates Silica gel 60 F254 Merck, Germany). В качестве растворителя использовали н-бутанол, уксусную кислоту и воду (4:1:1). Нингидрин добавляли в элюирующую смесь в концентрации 0,2%. Для измерения количества ГАМК в образцах использовали двумерное сканирование пластинок на денситометре Shimadzu CS-930, Japan (λ = 512).Опыты на крысах линии Спрэг-Доули. Опыты на животных проводили на кры- сах линии Спрэг-Доули; штаммом сравнения был пробиотический штамм L.rhamnosus GG, неспособным к синтезу ГАМК. В течение 15 дней 3 группы крыс (по 10 крыс в группе) получали соответственно стерильную питательную среду MRS, пробиотичесикй штамм L.rhamnosus GG и штамм L.plantarum 90sk. Первые две группы служили контролем. Бактериальные штаммы вводили ежедневно кры- сам через зонд в количестве 109 степени КОЕ. Стрессовым фактором служил хо- лодовой шок, индуцированный у крыс в результате снижения температуры до-40 °С в течение 45 сек. в последние 10 дней опыта. После этого крыс умерщвляли и удаляли из них кровь для измерения в ней уровня ГАМК и гормона стресса про- лактина.Результаты и обсуждениеИспользуя хроматографию на силикагеле, мы проверили коллекцию из 13 ви- дов лактобацилл и 3 видов бифидобактерий, выделенных из организма людей, на способность синтезировать и секретировать в среду ГАМК (табл. 1). Способностью секретировать ГАМК обладали 58 штаммов из 114 проверенных. Эта способность была видоспецифична, ею обладали виды L.plantarum, L.brevis и B.adolescentis, B.angulatum, B.dentium. Из 21 проверенного штамма L.fermentum, 28 штаммов L.rhamnosus и 11 штаммов L.casei ни один не секретировал ГАМК; не секретиро- вали ГАМК и единичные проверенные штаммы L.buchneri, L.helveticus, L.salivarius, L.sakei, L.reuteri, L.mucosa, L.crispatus, L.gasseri.Таблица 1Скрининг штаммов лактобацилл и бифидобактерий, способных к синтезу ГАМКВид лактобацилл и бифидобактерииКоличество проверенных штаммовКоличество штаммов-продуцентов ГАМКL. fermentum210L. rhamnosus280L. plantarum3030L. brevis33L. casei110L. helveticus20L. salivarius40L. sakei10L. reuteri30L. mucosa1053Вестник РУДН, серия Экология и безопасность жизнедеятельности, 2016, № 4Окончание табл. 1Вид лактобацилл и бифидобактерииКоличество проверенных штаммовКоличество штаммов-продуцентов ГАМКL. crispatus20L. buchneri30L. gasseri10B. adolescentis2121B. angulatum33B. dentium11Total11458Концентрация ГАМК в среде роста колебалась от 50 до 6000 мкг/мл. У лакто- бацилл она была больше у штаммов L.brevis (до 675 мкг/мл), чем у L. plantarum (до 300 мкг/мл); у бифидобактерий она была значительно выше (2500-6000 мкг/ мл) (табл. 2).Таблица 2Определение количества ГАМК, синтезируемой лактобациллами и бифидобактериямиВиды бактерийШтаммыУровень ГАМК, μg/млLactobacillus plantarum29st, 50/2, k13, 75sk, 14/4, 36st, 19/1A, 106zv,38/1До 5046sk, 3/1, 7/1, 52/1, CS396, K9L, 50st3, 43/3,119, 43/2, 56/151-1008-PA-3, 46k, 42/2, 191g, 57/1101-15043/5, 32sk, 43/4, 90sk, 29sk151-300Lactobacillus brevis47st,52st,50-10015f675Bifidobacterium adolescentis56, 174, 191, 104, 76,S11До 900108, 282, 48-2, 110, 44, S14, km4, 277, 44-2901-300057, 48, Tv29, km5-1, 152, 1503001-6000Bifidobacterium angulatum334-1, 212, GT1022616-3469Bifidobacterium dentium92465Лактобациллы, выделенные из продуктов питания (сыров, йогуртов, заквасок, традиционных продуктов корейской и китайской кухонь kimchi и paocai), демон- стрировали высокий уровень синтеза ГАМК. Максимальное количество ГАМК - 129 г/л - было получено у штамма L.buchneri WP2001 [19]. Для L.brevis макси- мальное количество ГАМК демонстрировали штаммы NCL912 и K203, 35,6 и 44,4 г/л соответственно [11; 19]. Для L.plantarum наибольшее количество ГАМК составило 0,5 г/л [3] и 1,16 г/л для штамма, содержащего дополнительный кло- нированный на плазмиде ген gadB [17]. Продукция ГАМК штаммами лактобацилл и бифидобактерий, выделенными из организма человека, была описана только в статье Barrett et al., 2012 и составила 32 г/л для L.brevis и 2,0-8,6 г/л для B.infantis, B.angulatum, B.dentium. Среди выделенных нами штаммов наблюдался значитель- ный разброс в количестве синтезируемой ГАМК. Для L.plantarum эти цифры были сходны с теми, которые были получены для штаммов, выделенных из продуктов питания, для L.brevis они были ниже; наибольшее количество ГАМК продуциро- вали штаммы бифидобактерий (B.angulatum, B.adolescentis, B.dentium) - до 6 г/л.54Юнес Р.А., Полуэктова Е.У., Дьячкова М.С. и др. Отбор бактерий-симбионтов рода Lactobacillus...На основе способности синтезировать ГАМК и других пробиотичнеских свой- ствах (антагонистическая, антиоксидантная активность) был отобран штамм L.plantarum 90sk. Для проверки предполагаемого антидепрессивного эффекта ГАМК-продуцирующего штамма L.plantarum 90sk были проведены опыты на кры- сах линии Спрэг-Доули (см. Материалы и методы, рис. 1).Рис. 1. Схема опыта по определению влияния штаммаL.plantarum 90sk на крыс в условиях холодового шокаμ mol/L2,521,510,5p < 0,05p < 0,010MRS L.rhamnosus GG L.plantarum 90skРис. 2. Количество ГАМК в крови крыс Спрэг-Доули по окончании опытаУровень ГАМК в крови крыс, получавших ГАМК-продуцирующий штамм, был достоверно выше по сравнению с двумя контрольными группами (MRS и L.rhamnosus GG) (см. рис. 2).55Вестник РУДН, серия Экология и безопасность жизнедеятельности, 2016, № 4Количество измеренного гормона стресса пролактина в крови крыс, получав- ших штамм L.plantarum 90sk, было достоверно ниже, чем у крыс, получающих стерильную среду MRS и штамм L.rhamnosus GG (рис. 3).ng/ml 16p < 0,0514121086420p < 0,05MRS L.rhamnosus GG L.plantarum 90skРис. 3. Количество пролактина в крови крыс Спрэг-Доули по окончании опытаУвеличение содержания ГАМК в крови крыс опытной группы свидетельству- ет о том, что штамм L.plantarum 90sk синтезировал ГАМК в кишечнике, которая затем попала в русло крови. Снижение уровня пролактина в крови крыс опытной группы говорит об адаптации крыс к стрессу, что хорошо описано в литературе [12]. Штамм L.plantarum 90sk является потенциальным психобиотиком, способ- ным облегчить синдром полярного напряжения, тем самым способствуя адапта- ции человека в условиях Крайнего Севера.

About the authors

R A Yunes

Vavilov Institute of General Genetics; Peoples’ Friendship University of Russia

Gubkin str., 3, Moscow, Russia, 119991; Podolskoe shosse, 8/5, Moscow, Russia, 113093

E U Poluektova

Vavilov Institute of General Genetics

Gubkin str., 3, Moscow, Russia, 119991

M S Dyachkova

Vavilov Institute of General Genetics

Gubkin str., 3, Moscow, Russia, 119991

Y E Kozlovski

Research Institute of Human Morphology

Tsyurupy str., 3, Moscow, Russia, 117418

V S Orlova

Peoples’ Friendship University of Russia

Podolskoe shosse, 8/5, Moscow, Russia, 113093

V N Danilenko

Vavilov Institute of General Genetics

Gubkin str., 3, Moscow, Russia, 119991

References