RUDN Journal of MedicineRUDN Journal of MedicineВестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина2313-02452313-0261Peoples’ Friendship University of Russia named after Patrice Lumumba (RUDN University)5207210.22363/2313-0245-2025-30-3-396-403KYJZTFPHARMACOLOGYФАРМАКОЛОГИЯResearch ArticleA new inhibitor binding site in bacterial RNA polymeraseНовый сайт связывания ингибитора в бактериальной РНК полимеразеhttps://orcid.org/0000-0003-1218-66184734-1668MironovKirill S.МироновК. С.molodtsov-vn@rudn.ru4375-7194MolodtsovVadim N.МолодцовВ. Н.molodtsov-vn@rudn.ruRUDN UniversityРоссийский университет дружбы народовN.P. Bochkov Research Center for Medical GeneticsМедико-генетический научный центр им. Академика Н.П. Бочкова30082026303CELL BIOLOGYКЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ39640331082026Copyright ©; 2026, Mironov K.S., Molodtsov V.N.Copyright ©; 2026, Миронов К.С., Молодцов В.Н.2026Mironov K.S., Molodtsov V.N.Миронов К.С., Молодцов В.Н.https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0https://journals.rudn.ru/medicine/article/view/52072

Relevance. Growing resistance of bacterial pathogens to antibiotics is a fundamental threat to healthcare worldwide. Many antibiotics currently used in clinical practice were developed decades ago, and their efficiency has been declining over time. Research efforts focusing on identification and optimization of new promising antibacterial compounds and new molecular targets in bacterial cells establish the foundation for developing new potent antibiotics relevant to modern day clinical needs. The bacterial RNA polymerase is a validated target for a number of natural, semisynthetic, and synthetic antibacterial compounds. This essential enzyme maintains a high potential for developing a new generation of antibiotics. Materials and methods. We prepared a complex of recombinant Escherichia coli RNA polymerase with a new small-molecule transcription inhibitor, and studied it using cryoelectron microscopy to determine the mechanism of inhibition. Results and discussion. The current work establishes the molecular basis of RNA polymerase inhibition by the compound N-(9H-fluoren-9-yl)-3-(2-methylpropyl)-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyridine-8-carboxamide (compound A) that blocks transcription through binding to a previously unknown binding site. We describe interactions of the compound A with RNA polymerase and reveal its mechanism of action that involves steric restriction of template DNA binding in the enzyme active site. We demonstrate that the compound A targets only certain types of transcription complexes since its binding site is formed in part by a dissociable subunit of RNA polymerase. Conclusion. The results of the study may be used for development of conjugates of rifamycins with the compound A to obtain a new class of bacterial RNA polymerase inhibitors with a new mechanism of action.

Актуальность. Растущая устойчивость бактериальных патогенов к антибиотикам представляет собой фундаментальную угрозу для здравоохранения во всем мире. Многие антибиотики, используемые в настоящее время в клинической практике, были разработаны десятилетия назад, и их эффективность со временем снижается. Исследования, направленные на идентификацию и оптимизацию новых перспективных антибактериальных соединений и новых молекулярных мишеней в бактериальных клетках, закладывают основу для разработки новых сильнодействующих антибиотиков, отвечающих современным клиническим потребностям. Бактериальная РНК-полимераза является подтвержденной мишенью для ряда природных, полусинтетических и синтетических антибактериальных соединений. Этот важный фермент обладает высоким потенциалом для разработки нового поколения антибиотиков. Материалы и методы. Мы получили комплекс рекомбинантной РНК-полимеразы Escherichia coli с новым низкомолекулярным ингибитором транскрипции и изучили его с помощью криоэлектронной микроскопии для определения механизма ингибирования. Результаты и обсуждение. В данной работе установлена молекулярная основа ингибирования РНК-полимеразы соединением N-(9H-флуорен-9-ил)-3-(2-метилпропил)-[1,2,4]триазоло[4,3-а]пиридин-8-карбоксамидом (соединение А), которое блокирует транскрипцию путем связывания с ранее неизвестным сайтом связывания. Мы описываем взаимодействие соединения А с РНК-полимеразой и раскрываем его механизм действия, который включает стерическое ограничение связывания матричной ДНК в активном центре фермента. Мы демонстрируем, что соединение А нацелено только на определенные типы транскрипционных комплексов, поскольку его сайт связывания частично образован диссоциируемой субъединицей РНК-полимеразы. Выводы. Результаты исследования могут быть использованы для разработки конъюгатов рифамицинов с соединением А с целью получения нового класса ингибиторов бактериальной РНК-полимеразы с новым механизмом действия.

bacterial transcriptionRNA polymeraseinhibitormechanism of actionБактериальная транскрипцияРНК полимеразаингибитормеханизм действияИсследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант РНФ 25-74-30007)This work was supported by the Russian Science Foundation grant № 25-74-30007 to V.N. MolodtsovFair RJ, Tor Y. Antibiotics and bacterial resistance in the 21st century. Perspect Medicin Chem. 2014;6:25–64. doi: 10.4137/PMC.S14459Bagchi A. Latest trends in structure based drug design with protein targets. Adv Protein Chem Struct Biol. 2020;121:1–23. doi: 10.1016/bs.apcsb.2019.11.008Varela MF, Kumar S. Strategies for discovery of new molecular targets for anti-infective drugs. Curr Opin Pharmacol. 2019;48:57–68. doi: 10.1016/j.coph.2019.04.015Neville N, Jia Z. Approaches to the structure-based design of antivirulence drugs: therapeutics for the post-antibiotic era. Molecules. 2019;24(3):378. doi: 10.3390/molecules24030378Villain-Guillot P, Bastide L, Gualtieri M, Leonetti JP. Progress in targeting bacterial transcription. Drug Discov Today. 2007;12(5–6):200–8. doi: 10.1016/j.drudis.2007.01.005Basu RS, Warner BA, Molodtsov V, Pupov D, Esyunina D, Fernández-Tornero C, Kulbachinskiy A, Murakami KS. Structural basis of transcription initiation by bacterial RNA polymerase holoenzyme. J Biol Chem. 2014;289(35):24549–59. doi: 10.1074/jbc.M114.584037Murakami KS, Darst SA. Bacterial RNA polymerases: the wholo story. Curr Opin Struct Biol. 2003;13(1):31–9. doi: 10.1016/s0959-440x(02)00005-2Ho MX, Hudson BP, Das K, Arnold E, Ebright RH. Structures of RNA polymerase-antibiotic complexes. Curr Opin Struct Biol. 2009 Dec;19(6):715–23. doi: 10.1016/j.sbi.2009.10.010Molodtsov V, Nawarathne IN, Scharf NT, Kirchhoff PD, Showalter HD, Garcia GA, Murakami KS. X-ray crystal structures of the Escherichia coli RNA polymerase in complex with benzoxazinorifamycins. J Med Chem. 2013;56(11):4758–63. doi: 10.1021/jm4004889Molodtsov V, Fleming PR, Eyermann CJ, Ferguson AD, Foulk MA, McKinney DC, Masse CE, Buurman ET, Murakami KS. X-ray crystal structures of Escherichia coli RNA polymerase with switch region binding inhibitors enable rational design of squaramides with an improved fraction unbound to human plasma protein. J Med Chem. 2015;58(7):3156–71. doi: 10.1021/acs.jmedchem.5b00050Zhang Y, Degen D, Ho MX, Sineva E, Ebright KY, Ebright YW, Mekler V, Vahedian-Movahed H, Feng Y, Yin R, Tuske S, Irschik H, Jansen R, Maffioli S, Donadio S, Arnold E, Ebright RH. GE23077 binds to the RNA polymerase 'i' and 'i+1' sites and prevents the binding of initiating nucleotides. Elife. 2014;3: e02450. doi: 10.7554/eLife.02450Lin W, Das K, Degen D, Mazumder A, Duchi D, Wang D, Ebright YW, Ebright RY, Sineva E, Gigliotti M, Srivastava A, Mandal S, Jiang Y, Liu Y, Yin R, Zhang Z, Eng ET, Thomas D, Donadio S, Zhang H, Zhang C, Kapanidis AN, Ebright RH. Structural Basis of Transcription Inhibition by Fidaxomicin (Lipiarmycin A3). Mol Cell. 2018;70(1):60–71.e15. doi: 10.1016/j.molcel.2018.02.026Lan T, Ganapathy US, Sharma S, Ahn YM, Zimmerman M, Molodtsov V, Hegde P, Gengenbacher M, Ebright RH, Dartois V, Freundlich JS, Dick T, Aldrich CC. Redesign of rifamycin antibiotics to overcome ADP-ribosylation-mediated resistance. Angew Chem Int Ed Engl. 2022;61(45): e202211498. doi: 10.1002/anie.202211498Ma Z, He S, Yuan Y, Zhuang Z, Liu Y, Wang H, Chen J, Xu X, Ding C, Molodtsov V, Lin W, Robertson GT, Weiss WJ, Pulse M, Nguyen P, Duncan L, Doyle T, Ebright RH, Lynch AS. Design, synthesis, and characterization of TNP‑2198, a dual-targeted rifamycin-nitroimidazole conjugate with potent Activity against Microaerophilic and Anaerobic Bacterial Pathogens. J Med Chem. 2022;65(6):4481–4495. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c02045Aristoff PA, Garcia GA, Kirchhoff PD, Showalter HD. Rifamycins — obstacles and opportunities. Tuberculosis (Edinb). 2010;90(2):94–118. doi: 10.1016/j.tube.2010.02.001Campbell EA, Korzheva N, Mustaev A, Murakami K, Nair S, Goldfarb A, Darst SA. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial rna polymerase. Cell. 2001;104(6):901–12. doi:Rupnik M, Wilcox MH, Gerding DN. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nat Rev Microbiol. 2009;7(7):526–36. doi: 10.1038/nrmicro2164Walker SS, Degen D, Nickbarg E, Carr D, Soriano A, Mandal M, Painter RE, Sheth P, Xiao L, Sher X, Murgolo N, Su J, Olsen DB, Ebright RH, Young K. Affinity Selection-Mass Spectrometry Identifies a Novel Antibacterial RNA Polymerase Inhibitor. ACS Chem Biol. 2017;12(5):1346–1352. doi: 10.1021/acschembio.6b01133Zheng SQ, Palovcak E, Armache JP, Verba KA, Cheng Y, Agard DA. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nat Methods. 2017;14(4):331–332. doi: 10.1038/nmeth.4193Rohou A, Grigorieff N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. J Struct Biol. 2015;192(2):216–21. doi: 10.1016/j.jsb.2015.08.008Zivanov J, Nakane T, Forsberg BO, Kimanius D, Hagen WJ, Lindahl E, Scheres SH. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION‑3. Elife. 2018;7: e42166. doi: 10.7554/eLife.42166Moriarty NW, Grosse-Kunstleve RW, Adams PD. electronic Ligand Builder and Optimization Workbench (eLBOW): a tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2009;65(Pt 10):1074–80. doi: 10.1107/S0907444909029436Liebschner D, Afonine PV, Baker ML, Bunkóczi G, Chen VB, Croll TI, Hintze B, Hung LW, Jain S, McCoy AJ, Moriarty NW, Oeffner RD, Poon BK, Prisant MG, Read RJ, Richardson JS, Richardson DC, Sammito MD, Sobolev OV, Stockwell DH, Terwilliger TC, Urzhumtsev AG, Videau LL, Williams CJ, Adams PD. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019;75(Pt 10):861–877. doi: 10.1107/S2059798319011471Emsley P, Lohkamp B, Scott WG, Cowtan K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(Pt 4):486–501. doi: 10.1107/S0907444910007493.Naryshkina T, Kuznedelov K, Severinov K. The role of the largest RNA polymerase subunit lid element in preventing the formation of extended RNA-DNA hybrid. J Mol Biol. 2006;361(4):634–43. doi: 10.1016/j.jmb.2006.05.034Pupov D, Petushkov I, Esyunina D, Murakami KS, Kulbachinskiy A. Region 3.2 of the σ factor controls the stability of rRNA promoter complexes and potentiates their repression by Dks A. Nucleic Acids Res. 2018;46(21):11477–11487. doi: 10.1093/nar/gky919Li L, Molodtsov V, Lin W, Ebright RH, Zhang Y. RNA extension drives a stepwise displacement of an initiation-factor structural module in initial transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(11):5801–5809. doi: 10.1073/pnas.1920747117Zuo Y, Steitz TA. Crystal structures of the E. coli transcription initiation complexes with a complete bubble. Mol Cell. 2015;58(3):534–40. doi: 10.1016/j.molcel.2015.03.010