Morphology of GFAP-Positive Cells in Male and Female Rats’ Cerebral Cortex during the Cerebral Hypoxia Development according to the Stress Tolerance Level

Cover Page

Abstract


Correlation between individual typological features like sex-related characteristics and low initial level of stress resistance and unfavorable prognosis of ischemic brain damage is shown. At the same time, the astrocytes’ participation in neuroplasticity in this disease represents the purpose of the study. The goal was to study the cerebral cortex astrocytes’ morphometric characteristics during the cerebral hypoxia in rats of different sexes with different stress tolerance levels. We performed the study with 72 Wistar rats. According to the Open Field test results all the animals were divided into two subgroups: with high and low level of stress tolerance. Both carotid arteries of the experimental group animals (48 animals) were bandaged. Animals were removed from the experiment at 21, 60 and 90 days after surgery. Glial fibrillary acidic protein (GFAP), a marker of mature astrocytes, was detected on histological sections of the central brain gyrus using primary polyclonal rabbit antibodies. Progressive decrease of the astrocytes’ numerical density and the number of first order processes were obtained during the study. It was less pronounced in animals with high stress tolerance and females. Increase of the processes’ distribution area was reliably detected. Area decreased after 90th day of the experiment. It is concluded that the astrocytes’ alteration develops earlier in animals with high stress tolerance and males, later in females (60 days) and animals with low stress tolerance (90 days).


В ходе клинических исследований показана взаимосвязь типологических особенностей человека и прогрессирования церебральной гипоксии. Показано, что низкий исходный уровень стрессоустойчивости ассоциирован с неблагоприятным прогнозом ишемического поражения головного мозга [1]. В экспериментальных исследованиях это подтверждается обнаружением биохимических эквивалентов уровня стрессоустойчивости, выявляемой в тесте «Открытое поле» на основании анализа двигательной активности животных. Это особенности метаболизма нейронов, заключающиеся в преобладании системы акцепторов водорода (НАД + НАДН) над системой макроэргов (АТФ и креатинфосфата) [2], повышение активности креатинкиназы и лактатдегидрогеназы в мозге низкоустойчивых животных, исходно большее напряжение стресс-активирующей системы и меньшая резервная емкость симпатоадреналовой системы у особей с низкой устойчивостью [3]. Несмотря на длительную историю изучения половых особенностей развития хронической ишемии головного мозга, интерес к ним поддерживается новыми открытиями. Показано, что по мере прогрессирования заболевания женщины, по сравнению с мужчинами, подвергаются более высокому риску развития дискинезий и осложнений, связанных с лечением, также, у женщин эффективность терапии, как правило, ниже [4]. В связи с этим представляет интерес поиск морфологических эквивалентов типологических особенностей, оказывающих влияние на развитие церебральной гипоксии. Среди клеток коры головного мозга астроциты обладают одним из самых больших спектров эффектов. В норме и при гипоксии нервной ткани они обеспечивают трофическую функцию, нейроваскулярное ремоделирование и модуляцию, а также участвуют в регуляции нервной пластичности. Кроме того, они играют значительную роль в реализации саногенетических эффектов физической нагрузки и обогащенной среды при развитии церебральной гипоперфузии [5]. Цель исследования - изучить динамику морфометрических показателей астроцитов коры больших полушарий головного мозга при моделировании церебральной гипоксии у самцов и самок крыс с различным уровнем стрессоустойчивости. Материалы и методы Исследования проводили на 72 крысах Wistar (36 самцов и 36 самок) массой 180-220 г. Животные содержались в стандартных условиях на рационе вивария и были разделены на две группы: первая - контрольная - 24 (12 самцов и 12 самок), у животных второй группы (24 самца и 24 самки) моделировали субтотальную ишемию головного мозга. Эксперимент одобрен Этическим комитетом ФБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России (протокол № 8 от 24.03.16) и выполнен в соответствии с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», Хельсинкской декларации 1975 г. и ее пересмотренного варианта 2000 г. и этических норм и рекомендаций по гуманному обращению с животными, используемыми в экспериментальных и других научных целях (приказ Минздрава России от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики»). Ориентировочно-исследовательское поведение животных оценивалось перед включением животных в эксперимент для разделения их на подгруппы с помощью теста «открытое поле». По результатам тестирования 24 исследуемых животных были разделены на две одинаковые по численности подгруппы: животные с низким и высоким уровнем тревожности, которым соответствует высокий (ВУС/HLT) и низкий уровень стрессоустойчивости (НУС/LST), по 12 животных в каждой подгруппе. Моделирование субтотальной ишемии головного мозга проводили при помощи постоянной одномоментной необратимой билатеральной окклюзии общих сонных артерий [6]. Операция проводилась под внутрибрюшинным наркозом золетилом, из расчета 20-40 мг/кг, который вводили за 40 минут до начала моделирования. Выживших после операции животных (24 самца и 24 самки) выводили из эксперимента наркозом золетилом [7], спустя 21, 60 и 90 суток после операции (по 16 животных, из которых 8 животных с ВУК и 8 животных с НУК). Фрагмент прецентральной извилины головного мозга фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, дальнейшая проводка осуществлялась промежуточными смесями Блик. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали с помощью HM 450 SlidingMicrotome. Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), маркер зрелых астроцитов, выявляли с помощью первичных поликлональных кроличьих антител (ab16997, UK, разведение 1 : 200) и вторичных антител (ab97051, UK, 1 : 1000) с пероксидазной меткой на парафиновых парасагиттальных срезах мозга. Детекцию пероксидазы производили DAB SubstrateKit (ab64238). Срезы докрашивали гематоксилином Майера, промывали в воде, обезвоживали, заключали в канадский бальзам. Для контроля и исключения артефактов при выполнении реакции часть препаратов обрабатывали только вторичными антителами, без нанесения первичных антител. Маркер GFAP выявляется в цитоплазме и в отростках астроцитов. Астроциты после проведения иммуногистохимической реакции визуализируются как клетки округлой или полигональной формы со светлым ядром и с 3-5 извитыми ветвящимися отростками. На каждом срезе в 50 полях зрения оценивались численная плотность распределения астроцитов (ед/мм2), количество отростков у астроцитов, средняя площадь распределения отростков астроцитов (мкм2). Морфометрия осуществлялась с использованием программного обеспечения (ImageJ). Статистическая обработка данных включала вычисление среднеарифметического значения, его ошибки, оценки амплитуды вариационного ряда. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента и считали их значимыми при p < 0,05. Взаимосвязанность изменения средних оценивали при помощи коэффициента корреляции Кендала (τ). По полученным средним значениям для каждого срока исследования для подгрупп животных с ВУК и с НУК проводился факторный анализ при помощи Statistica 6.0. В качестве метода выделения факторов был использован метод главных компонент. После приведения к главным компонентам была проведена нормировка при помощи ортогонального метода «варимакс нормализованных значений», последний максимизирует разброс квадратов нагрузок для каждого фактора, что приводит к увеличению больших и уменьшению малых значений факторных нагрузок. Результаты исследования При изучении численной плотности распределения астроцитов в коре больших полушарий головного мозга было установлено ее снижение во все сроки эксперимента во всех изучаемых подгруппах. Однако наиболее выраженная убыль клеток для подгруппы животных с ВУС была характерна в ранние сроки (61% от показателей интактных животных, и только 46%, в подгруппе НУС), в более поздние сроки исследования - на 90 сутки, более интенсивно теряли астроциты животные с НУС (44% от показателей 60-ти суток, и только 17% в подгруппе ВУС). Динамика количества главных отростков астроцитов у животных с разным уровнем стрессоустойчивости была аналогичной, за тем лишь исключением, что у животных с ВУС на 90 суток эксперимента вместо убыли отмечался достоверный прирост количества главных отростков астроцитов (12% по сравнению с показателем 60-ти суток), в то время как у животных с НУС отмечалась отрицательная динамика (снижение на 15%). Численная плотность распределения астроцитов в коре больших полушарий головного мозга самцов характеризуется самыми низкими цифрами у интактных животных и самой быстрой убылью астроцитов на протяжении всех изучаемых сроков по сравнению с показателями самок. В то же время половые отличия сохраняются на протяжении всего исследования (на 90-е сутки исследования разница между подгруппами составляет 55%, а на 21 сутки 38%), а при делении животных на подгруппы по уровню стрессоустойчивости различия с альтернативной группой в начале нарастают (на 20-е, 60-е сутки разница составляет 36% и 28% соответственно), а в конце исследования нивелируются. Динамика числа главных отростков астроцитов (до первого ветвления) у самок полностью повторяет динамику у животных с ВУС (τ = 1), а динамика аналогичного показателя самцов, аналогична динамике животных с НУС (τ = 1). Таблица 1 / Table 1 Численная плотность астроцитов и количества их главных отростков у животных с разным уровнем стрессоустойчивости / The numerical density of astrocytes and the number of their primary processes in rats with different levels of stress resistance Сутки эксперимента / Days Численная плотность астроцитов (ед./мм2) / The numerical density of astrocytes (U/mm2) Количество главных отростков астроцитов / The number of primary processes of astrocytes Подгруппа с ВУС / HST Подгруппа с НУС / LST Подгруппа с ВУС / HST Подгруппа с НУС / LST 0 107,9 ± 4,6# 118,6 ± 6,1 3,8 ± 0,1# 4,1 ± 0,2 21 42,6 ± 3,0*# 63,8 ± 4,6* 2,6 ± 0,1*# 3 ± 0,2* 60 27,4 ± 1,5*# 38,0 ± 3,2* 2,6 ± 0,1*# 3 ± 0,2* 90 22,8 ± 1,8* 21,3 ± 1,9* 2,9 ± 0,2* 2,6 ± 0,2* *Различия с контрольной группой достоверны / Statistically significant with the control group. #Различия с показателями подгруппы животных с НУС достоверны / Statistically significant with the LST group. Таблица 2 / Table 2 Половые особенности численной плотности астроцитов и количества их главных отростков / Sexual characteristics of the numerical density of astrocytes and the number of primary processes Сутки эксперимента / Days Численная плотность распределения астроцитов (ед/мм2) / The numerical density of astrocytes (U/mm2) Количество главных отростков астроцитов / The number of primary processes of astrocytes Самцы / Males Самки / Females Самцы / Males Самки / Females 0 104,9 ± 4,6# 121,5 ± 6,3 4,1 ± 0,4 3,8 ± 0,3 21 38,0 ± 2,9*# 68,3 ± 4,5* 2,9 ± 0,1*# 2,6 ± 0,1* 60 38,0 ± 1,7*# 28,8 ± 1,7* 2,9 ± 0,1*# 2,6 ± 0,1* 90 13,7 ± 1,9*# 30,3 ± 3,1* 2,7 ± 0,2* 2,9 ± 0,2* *Различия с контрольной группой достоверны / Statistically significant with the control group. #Различия с показателями подгруппы самок достоверны / Statistically significant with the females group. Отличительной особенностью динамики средней площади распределения главных отростков астроцитов у животных с ВУС является ее достоверное увеличение на 21 сутки эксперимента (18% для средней площади распределения главных отростков и 53% для средней площади распределения отростков второго и третьего порядков), в то время как у животных с НУС рост площади происходит позднее - на 60-е сутки (на 83% для средней площади распределения главных отростков и на 94% для средней площади распределения отростков второго и третьего порядков). Во все остальные сроки, как у животных с ВУС, так и у животных с НУС, эти показатели постоянно снижаются. Межгрупповые отличия, выявленные у интактных животных для средней площади распределения отростков второго и третьего порядка (достоверно большая средняя площадь распределения отростков астроцитов у животных с НУС), в конце исследования сохраняются, а межгрупповые отличия для средней площади распределения главных отростков (достоверно большая средняя площадь, распределения отростков астроцитов у животных с НУС) к 90-м суткам меняются на противоположные. На протяжении исследования в обеих подгруппах отмечается снижение средней площади распределения отростков астроцитов, за исключением 21-х суток, когда у животных с ВУС отмечается прирост по сравнению с показателями интактных животных (на 18% - для средней площади распределения главных отростков, на 53% для средней площади распределения отростков второго и третьего порядков). В дальнейшем средняя площадь распределения главных отростков в подгруппе животных с ВУС достоверно не отличается от показателей интактных животных, в то время как другие показатели остаются по отношению к показателям интактных животных достоверно ниже. Таблица 3 / Table 3 Средняя площадь распределения отростков астроцитов у крыс с разным уровнем стрессоустойчивости / Mean area distribution of the astrocytes processes in rats with different levels of stress resistance Сутки эксперимента / Days Средняя площадь распределения главных отростков астроцитов (мкм2) / Mean area distribution of primary processes GFAP-immunoreactive astrocytes (mkm2) Средняя площадь распределения отростков второго и третьего порядков астроцитов (мкм2) / Mean area distribution of the second and third order processes GFAP-immunoreactive astrocytes (mkm2) Подгруппа с ВУС/HST Подгруппа с НУС/ LST Подгруппа с ВУС /HST Подгруппа с НУС/ LST 0 167 ± 8# 198 ± 8 353 ± 10# 469 ± 11 21 197 ± 10*# 88 ± 5* 543 ± 11#* 143 ± 10* 60 180 ± 10 83 ± 11* 238 ± 8#* 278 ± 11* 90 172 ± 10# 148 ± 8* 67 ± 5#* 153 ± 11* *Различия с контрольной группой достоверны / Statistically significant with the control group. #Различия с показателями подгруппы самок достоверны / Statistically significant with the females group. Таблица 4 / Table 4 Половые особенности средней площади распределения отростков астроцитов / Sexual characteristics of the mean area distribution of astrocyte processes Сутки эксперимента / days Средняя площадь, распределения главных отростков астроцитов (мкм2) / Mean area distribution of primary processes GFAP-immunoreactive astrocytes (mkm2) Средняя площадь, распределения отростков второго и третьего порядков астроцитов (мкм2) / Mean area distribution of the second and third order processes GFAP-immunoreactive astrocytes (mkm2) Самцы / Males Самки / Females Самцы / Males Самки / Females 0 190 ± 13 182 ± 12 379 ± 12 456 ± 11 21 98 ± 8*# 187 ± 11 371 ± 11# 315 ± 10* 60 151 ± 8*# 192 ± 10 297 ± 10*# 219 ± 10* 90 167 ± 10*# 153 ± 8* 68 ± 8*# 158 ± 9* *Различия с контрольной группой достоверны / Statistically significant with the control group. #Различия с показателями подгруппы самок достоверны / Statistically significant with the females group. Таблица 5 / Table 5 Результаты факторного анализа / Factor Analysis Results Изучаемый параметр / Parameter Подгруппа животных / Subgroup of animals Факторные нагрузки Фактор А / Factor A Фактор Б / Factor B Численная плотность распределения астроцитов (ед/мм2) / The numerical density of astrocytes (unit / mm2) ВУС / HST 0,99 0,09 НУС / LST 0,95 0,30 Количество главных отростков астроцитов / Number of their primary processes of astrocytes ВУС / HST 0,94 -0,33 НУС / LST 0,98 0,16 Численная плотность распределения астроцитов (ед/мм2) / The numerical density of astrocytes (unit / mm2) Самцы / Males 0,98 0,16 Самки / Females 0,93 0,23 Количество главных отростков астроцитов / Number of their primary processes of astrocytes Самцы / Males 1 0,02 Самки / Females 0,94 -0,33 Средняя площадь распределения главных отростков астроцитов (мкм2) / Mean area distribution of primary processes GFAP-immunoreactive astrocytes (mkm2) ВУС / HST -0,53 0,82 НУС / LST 0,78 -0,57 Средняя площадь, распределения отростков второго и третьего порядков астроцитов (мкм2) / Mean area distribution of the second and third order processes GFAP-immunoreactive astrocytes (mkm2) ВУС / HST 0,27 0,93 НУС / LST 0,92 -0,09 Средняя площадь распределения главных отростков астроцитов (мкм2) / Mean area distribution of primary processes GFAP-immunoreactive astrocytes (mkm2) Самцы / Males Самцы / Males -0,76 Самки / Females Самки / Females 0,83 Средняя площадь, распределения отростков второго и третьего порядков астроцитов (мкм2) / Mean area distribution of the second and third order processes GFAP-immunoreactive astrocytes (mkm2) Самцы / Males Самцы / Males 0,82 Самки / Females Самки / Females 0,39 Общая дисперсия / Total variance 10,77 4,36 Доля общей дисперсии, объясняемая фактором / % of total variance explained by factor 67% 27% Динамика показателей средней площади распределения отростков второго и третьего порядков астроцитов в зависимости от пола животного (табл. 4) характеризуется снижением по отношению к показателям интактных животных в обеих изучаемых подгруппах. У самцов особенностью средней площади распределения главных отростков является сильное ее снижение в ранние сроки исследования (на 48% от показателей интактных животных), в то время как у самок достоверно не изменяется. По результатам факторного анализа для объяснения изменения наблюдаемых параметров достаточно двух факторов, которые в сумме учитывают 94% их дисперсии. Примечательно, что большие факторные нагрузки Фактора Б ассоциированы со средней площадью распределения главных отростков астроцитов у самок и средней площадью распределения отростков второго и третьего порядка у самцов (табл. 5). Обсуждение результатов исследования Выявленное в нашем исследовании сильное снижение в ранние сроки исследования средней площади распределения главных отростков астроцитов, ассоциированное с мужским полом, согласуется с известным комплексом биохимических нарушений в астроцитах, характерных для самцов и реализующихся при гипоксии-ишемии головного мозга, приводящим к митохондриальной недостаточности астроцитов. У клеток коры мужского мозга отмечено более сильное немедленное снижение астроцитарных функций после воздействия циркуляторной гипоксии, но при этом более быстрое восстановление. В то же время у женского мозга немедленная депрессия менее выражена, но более продолжительна [8]. Важным этапом факторного анализа является процедура содержательной интерпретации выделенных факторов с медико-биологических позиций [9]. Фактор А ассоциирован с показателями численной плотности распределения астроцитов, количеством главных отростков астроцитов. Учитывая большие показатели факторной нагрузки площадей распределения отростков для Фактора А у животных с низкой стрессоустойчивостью, а также литературные данные о большем повреждающем воздействии гипоксии на структуры головного мозга у животных с НУС [2], Фактор А, на наш взгляд, можно интерпретировать как влияние механизмов, связанных с альтерацией. Фактор Б, наоборот, имеет большие факторные нагрузки для всех показателей площади распределения отростков астроцитов животных с ВУС. Учитывая роль, которую играют перисинаптические отростки астроцитов в регуляции нейропластичности [10], мы рассматриваем этот фактор как проявление адаптационно-компенсаторных изменений. Выводы 1. При хронической церебральной гипоперфузии отмечается прогрессирующее снижение численной плотности астроцитов и количества главных отростков астроцитов, менее выраженное у животных с высокой стрессоустойчивостью и самок. 2. Увеличение площади ветвления отростков является адаптационно-компенсаторным механизмом, который к 90-м суткам влияния фактора исчерпывается. 3. Отмечается гетерохрония развития альтерационных повреждений астроцитов, более ранние характерны для животных с высокой стрессоустойчивостью и самцов, более поздние для самок (60 сутки) и животных с низкой стрессоустойчивостью (90 сутки).

V. V. Chrishtop

Ivanovo State Medical Academy; Saint Petersburg National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics

Author for correspondence.
Email: chrishtop@mail.ru
Ivanovo, Russian Federation; Saint Petersburg , Russian Federation

T. A. Rumyanceva

Yaroslavl State Medical University

Email: chrishtop@mail.ru
Yaroslavl, Russian Federation

D. A. Pozhilov

Yaroslavl State Medical University

Email: chrishtop@mail.ru
Yaroslavl, Russian Federation

  • Antipenko EA, Gustov AV. Individual stress resistance and prognosis of disease in the case of chronic ishemia of brain. Meditsinskiy almanakh. 2014;3(33): 36—38. (In Russ.).
  • Kryzhanovsky GN. Disregulation pathology: a guide for physicians and biologists. Moscow: Meditsina; 2002: 260—270. (In Russ.).
  • Zarubina IV. Molecular mechanisms of individual hypoxia resistance. Reviews on clinical pharmacology and drug therapy. 2005;4(1): 49—51. (In Russ.).
  • Jov M, Portero-Otin M, Naudi A, Ferrer I, Pamplona R. Metabolomics of human brain aging and age-related neurodegenerative diseases. J Neuropathol Exp Neurol. 2014;73(7): 640—57.
  • Chen X, Zhang X, Liao W, Wan Q, Effect of physical and social components of enriched environment on astrocytes proliferation in rats after cerebral ischemia/reperfusion injury. Neurochem Res. 2017;42(5): 1308—16.
  • Bon EI, Maksimovich NE. Methods of modeling and morphofunctional markers of cerebral ischemia. Biomedicine. 2018;(2): 59—71. (In Russ.).
  • Chrishtop VV, Pakhrova OA, Rumyantseva TA. Dynamics of permanent cerebral hypoxia of rats depending on individual features of higher nervous activity and sex. Medical news of the north caucasus. 2018;13(4): 654—9. (In Russ.).
  • Morken TS, Brekke E, Håberg A, Widerøe M, Brubakk AM, Sonnewald U. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke. 2014 Sep; 45(9): 2777—85. doi: 10.1161/Strokeaha.114.005341.
  • Deputat IS, Bolshevidtseva IL. Brain energy metabolism in elderly women with a high level of anxiety: factor analysis // In the collection: Clinical, biological, psychological aspects of psychiatry and narcology materials of an interregional scientific-practical conference with international participation edited by D.M. Ivashinenko. 2016. 19 p. (In Russ.).
  • Shvalev VN, Sosunov AA, Chelyshev Yu.A. Astrocytes and plasticity of synapses. Part I. Synaptogenic molecules // Neurological Bulletin. 2018;50(2): 55—60. (In Russ.).

Views

Abstract - 108

PDF (Russian) - 57

PlumX


Copyright (c) 2019 Chrishtop V.V., Rumyanceva T.A., Pozhilov D.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.