Актуальность. Гликопротеин-P (P-gp) - эффлюксный АТФ-зависимый белок-транспортер (АВСВ1-белок), локализующийся на апикальной мембране эпителиоцитов слизистой оболочки кишечника и проксимальных канальцев нефронов, на билиарной поверхности гепатоцитов, в гистогематических барьерах, а также в форменных элементах крови и опухолевых клетках. Основной физиологической функцией P-gp является поддержание внутриклеточного гомеостаза за счет экскреции липофильных ксенобиотиков и биобиотиков из клеток во внеклеточное пространство или полости органов. Кроме того, P-gp играет ключевую роль в фармакокинетике целого ряда лекарственных веществ, обеспечивая их выведение из клетки. Функциональная активность P-gp вариабельна и зависит от генетических особенностей организма, действия факторов внешней и внутренней среды, применения лекарственных средств [1]. Повышение активности белка-транспортера приводит к снижению всасывания лекарственных веществ в кишечнике, усилению их экскреции печенью и почками и, как следствие, к неэффективности проводимой фармакотерапии. Снижение функционирования Pgp может стать причиной относительной передозировки и нежелательных лекарственных реакций [2]. Поскольку в роли регуляторов АВСВ1-белка способны выступать эндогенные соединения, для эффективной и безопасной фармакотерапии очевидна необходимость учета изменений со стороны P-gp на фоне различных патологий. Целью настоящего исследования явилось изучение функциональной активности и экспрессии гликопротеина-P у кроликов на фоне сахарного диабета (СД) 2-го типа. Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 16 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла, средней массой 3500-4500 г [3]. Работу с животными осуществляли в соответствии с правилами лабораторной практики (прил. к приказу Минздравсоцразвития РФ № 708н от 23.08.2010). У животных моделировали СД 2-го типа (n = 8) и изучали изменения уровня инсулина, глюкозы, функциональной активностии экспрессии P-gp на фоне развившейся патологии. Группа контроля для изучения экспрессии белка-транспортера на фоне нормы включала 8 животных. Сахарный диабет моделировали однократным внутривенным введением раствора аллоксана моногидрата в цитратном буфере (pH = 4,0) в дозе 80 мг/кг массы. Кролики, у которых через месяц после инъекции уровень глюкозы натощак был не более 13,89 ммоль/л на фоне сохраненной секреции базального инсулина; концентрация постпрандиальной глюкозы (120 минута) отличалась от базальной, а инсулиногенный индекс и уровень инсулина на 45 минуту после пероральной глюкозной нагрузки были снижены, признавались больными СД 2-го типа [4; 5]. Уровень инсулина в сыворотке крови определяли натощак, на 10 и 45 минуты после пероральной глюкозной нагрузки (3 г/кг). Сывороточную концентрацию глюкозы измеряли натощак, на 10, 90 и 120 минуты после глюкозной нагрузки, рассчитывали гликемический и инсулиногенный индексы [4; 5]. Содержание глюкозы (ммоль/л) определяли глюкозоксидазным методом с использованием наборов «Human» (Германия), инсулин (мкЕД/мл) - радиоиммунным методом с применением набора «Immunotech» (Чехия). Функциональную активность P-gp определяли по анализу плазменной концентрации маркерного субстрата фексофенадина («Телфаст» 180 мг, Aventis Pharma, Италия) в плазме крови после его однократного внутрижелудочного введения в дозе 67,5 мг/кг массы тела [3; 6]. Пробы крови забирали из краевой вены уха кролика через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 часа после введения препарата, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин, плазму хранили до анализа при -28 °C. Концентрации фексофенадина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ на хроматографе «Стайер» (Россия) с УФ-спектрофотометрическим детектором UVV104 и обращено-фазовой колонкой Ultrasphere фирмы «Вескman Coulter» 4,6*250 мм (зернение 5 мкм). Экстракцию фексофенадина осуществляли с применением дихлорметана («ACROSORGANICS»), этилацетата («ACROSORGANICS») и диэтилового эфира («ХИММЕД»). Элюирование выполняли подвижной фазой следующего состава (на 200 мл): 64 мл ацетонитрила, 133,7 мл бидистиллированной воды, содержащей 2,33 мл ледяной уксусной кислоты («ХИММЕД»), и 0,936 мл триэтиламина («ACROSORGANICS»). pH подвижной фазы доводили до 5,0 триэтиламином. Время удерживания пика фексофенадина составило 12,31 ± 0,01 мин. При помощи программы «Kinetica 5.0» рассчитывали фармакокинетические параметры фексофенадина: Сmax - максимальная концентрация (нг/мл);Тmax - время достижения максимальной концентрации (ч); AUC0-t - площадь под кривой «концентрация-время» от нуля до последнего забора крови (нг/мл)×ч; AUC0-∞ - площадь под кривой «концентрация-время» от нуля до бесконечности (нг/мл)×ч; T1/2 - период полувыведения (ч); MRT - среднее время удерживания препарата в системном кровотоке (ч); общий клиренс (л/ч); Vd - объем распределения (л). Экспрессию P-gp определяли непрямым иммуногистохимическим методом. Для этого кроликов выводили из эксперимента методом воздушной эмболии. Забирали образцы тощей кишки, печени, почек и коры больших полушарий головного мозга, которые фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина. Гистологический материал подвергали стандартной обработке: производили обезвоживание в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветляли ксилолом, с последующим заключением в парафин. Перед реакцией иммунного окрашивания производили демаскировку антигенов тканей нагреванием на водяной бане в 10 мМ цитратном буфере (рН = 6,0), блокировали эндогенную пероксидазу 3%-м раствором пероксида водорода. Срезы инкубировали с первичными антителами к P-gp (ABCB1 antibody - middleregion, 100 мкл (Aviva Systems Biology ARP51326_P050, США)) в разведении 1 : 50. Для иммунного окрашивания применяли полимерную систему детекции с пероксидазной меткой («Leica Microsystems», Германия). Ядра клеток докрашивали гематоксилином. Микропрепарат фотографировали с помощью цифровой камеры Canon Power Shot G5 при увеличении в 400 раз. В каждом гистологическом препарате оценивали 10 репрезентативных участков. В дальнейшем изображения анализировали с помощью программы «ImageJ» и плагина «IHCProfiler» [108]. Уровень экспрессии определяли в «+», по интенсивности и площади окраски («+++» - высокая, «++» - умеренная, «+» - слабая, 0 - отсутствие экспрессии). Интенсивность окраски «диаминобензидина» оценивали количественно в диапазоне от 0 (черное) до 255 (белое). Полученные экспериментальные данные были подвергнуты математико-статистической обработке с использованием офисного пакета «Microsoft Office XP» и программ Statistica 8.0 и IBM SPSS Statistics 20. Характер распределения данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Для фармакокинетических параметров (за исключением Тmax) рассчитывали двухсторонний 90% доверительный интервал отношения средних геометрических после предварительного логарифмирования значений изучаемых параметров фармакокинетики у интактных кроликов и на фоне СД 2-го типа. Достоверными принимались различия между фармакокинетическими параметрами, двухсторонний 90% доверительный интервал отношения средних геометрических которых полностью находился за пределами диапазона 80-125% (0,8-1,25), (т.е. -20%; +25%) [7]. Полученные результаты представлялись в виде среднего геометрического (Geom. mean) и его 95% доверительного интервала (95% CI (ДИ)). Статистическую значимость для Тmax рассчитывали при помощи критерия Уилкоксона, без определения характера распределения. Для исследования статистической значимости изменений уровней инсулина и глюкозы в крови в случае нормального распределения данных применяли парный критерий Стьюдента. Для оценки показателей, распределение которых отличалось от нормального, использовали критерий Уилкоксона. Результаты в таблицах представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения среднего арифметического (M ± SD) в случае нормального распределения данных; медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq) в случае отличного от нормального распределения данных. Изучение статистической значимости изменений экспрессии P-gp проводили критерием Манна-Уитни. Для описания данных использовали моду (Mode) и размах вариации (Range (R)), а также медиану (Median) и верхний и нижний квартили (lq; uq). Результаты и их обсуждение. У кроликов с аллоксан-индуцированным СД 2-го типа отмечалось достоверное уменьшение (p < 0,05) уровня инсулина на 45-й минуте после глюкозной нагрузки на 72,05% и инсулиногенного индекса на 99,81%, а также повышение (p < 0,05) содержания глюкозы на 90-й минуте на 130% и на 120-й минуте на 190,94% после глюкозной нагрузки по сравнению со значениями интактных животных (табл. 1). Таблица 1 Изменения уровней инсулина и глюкозы на фоне аллоксан-индуцированного сахарного диабета 2-го типа (Mean ± SD или Media (lq; uq)) Изучаемые параметры Исходные значения (n = 8) СД 2-го типа (n = 8) Инсулин 45 мин, мкЕД/мл 16,96 ± 4,65 4,74 ± 2,58c Глюкоза 90 мин, ммоль/л 7,80 ± 1,22a,b 17,94 ± 2,62a,c Глюкоза 120 мин, ммоль/л 6,29 ± 0,91 18,30 ± 2,59a,c Гликемический индекс натощак 1,23 ± 0,4 2,11 ± 1,21 Инсулиногенный индекс на 10-й минуте 0,9873 (0,4154; 18,4301) 0,0019 (-0,0639; 0,1143)1 Примечание: a - уровень значимости < 0,05 (p < 0,05) по сравнению со значениями базальной глюкозы в соответствующем периоде (исходные значения, СД 2-го типа); b - уровень значимости < 0,05 (p < 0,05) по сравнению со значениями глюкозы на 120 минуту после глюкозной нагрузки в соответствующем периоде (исходные значения, СД 2-го типа); c - уровень значимости < 0,05 (p < 0,05) по сравнению с исходными значениями. Анализ фармакокинетических параметров фексофенадина на фоне СД 2-го типа показал следующие достоверные изменения по сравнению с исходными значениями (табл. 2): увеличение Geom. mean Сmax на 82,96% (90% ДИ ↑ 62,03%; ↑ 106,59%); увеличение Geom. mean T1/2 на 120,81% (90% ДИ ↑ 37,08%; ↑ 255,67%); увеличение Geom. mean AUC0-t на 103,78% (90% ДИ ↑ 63,23%; ↑ 154,36%); увеличение Geom. mean AUC0-∞ на 208,89% (90% ДИ ↑ 97,85%; ↑ 382,26%); увеличение Geom. meanMRT на 109,07% (90% ДИ ↑ 31,38%; ↑ 232,7%); снижение Geom. mean Cl на 67,63% (90% ДИ ↓ 49,46%; ↓ 79,27%); снижение Geom. mean Vd на 32,34% (90% ДИ ↓ 22,34%; ↓ 41,06%). Фексофенадин является маркерным субстратом P-gp, так как его фармакокинетика зависит только от функционирования данного белка-транспортера, который препятствует его всасыванию в кишечнике и способствует выведению с желчью (90%) и мочой (10%) [8]. Изменения параметров фармакокинетики фексофенадина при СД 2-го типа (увеличение Сmax, T1/2, AUC0-t, AUC0-∞, MRT и уменьшение Cl и Vd фексофенадина) свидетельствуют об увеличении концентрации препарата в крови за счет повышения всасывания и снижения экскреции, что указывает на ингибирование функциональной активности ABCB1-белка на фоне СД 2-го типа. Таблица 2 Усредненные фармакокинетические параметры фексофенадина (67,5 мг/кг) у кроликов на фоне сахарного диабета 2-го типа (Media (lq; uq)/Geom. Mean (95% CI (ДИ))) Изучаемые параметры Исходные значения (n = 8) СД 2-го типа (n = 8) Сmax, нг/мл 124,29 (102,36; 150,92) 227 (186,29; 277,6)1 Тmax, ч 3,5 (3; 4) 4 (3; 5) T½, ч 11,69 (8,07; 16,93) 25,8 (15,75; 42,29)1 AUC0-t, (нг/мл)×ч 1212,40 (1073,58; 1369,16) 2470,47 (2032,73; 3002,48)1 AUC0-∞, (нг/мл)×ч 1762,41 (1454,20; 2135,93) 5443,95 (3393,50; 8733,35)1 Cl, л/ч 2974,29 (2293,80; 3856,65) 2012,31 (1645,67; 2460,63)1 Vd, л 163,33 (134,94; 197,69) 52,87 (34,86; 80,19)1 MRT, ч 18,20 (12,89; 25,69) 38,05 (23,66; 61,20)1 Примечание: 1 - двухсторонний 90% доверительный интервал отношения средних геометрических к средним геометрическим исходных значений, не укладывающийся в пределы диапазона 80-125% (0,8-1,25),(т.е. -20%; +25%) (CД 2-го типа/исходные значения). № Тощая кишка Печень Почка Головной мозг 1 «0» «0» «0» «0» 2 «2+» «2+» «1+» «2+» 3 «0» «1+» «0» «2+» Рис. 1. Иммуногистохимическая картина экспрессии гликопротеина-Р у интактных кроликов и животных с аллоксан-индуцированным сахарным диабетом 2-го типа (×400 раз) Примечание: 1 - без первичных антител в тканях интактных кроликов; 2 - с первичными антителами (группа контроля) в тканях интактных кроликов; 3 - аллоксан-индуцированный сахарный диабет 2-го типа Таблица 3 Экспрессия в «+» гликопротеина-Р в тканях кроликов на фоне аллоксан-индуцированного сахарного диабета 2-го типа (Mode (R)/Media (lq; uq)) Орган Контроль (интактные кролики) (n = 8) СД 2-го типа (n = 8) Тощая кишка 2(1)/2 (2;2) 0(1)/0 (0;1)1 Печень 2(1)/2 (2;2) 1(1)/1 (1;1)1 Почка 1 (0)/1 (1;1) 0 (1)/0 (0;0,5)1 Мозг 2(1)/2 (2;2) 2(0)/2 (2;2) Примечание: 1 - уровень значимости < 0,05 (p < 0,05) по сравнению с исходными значениями. При исследовании экспрессииP-gpу кроликов с СД 2-го типа выявлено ее достоверное уменьшение в тканях тощей кишки, печени и почек (p < 0,05), при этом экспрессия белка-транспортера в гематоэнцефалическом барьере оставалась неизменной (рис., табл. 3). Таким образом, на фоне аллоксан-индуцированного СД 2-го типа отмечается снижение транспортной функции ABCB1-белка в результате ингибирования его функциональной активности и экспрессии, сопровождающееся уменьшением уровня постпрандиального инсулина и инсулиногенного индекса и повышением содержания постпрандильной глюкозы в крови. Известно, что инсулин и глюкоза являются эндогенными регуляторами P-gp. В исследовании in vitro выявлено, что повышение уровня глюкозы приводит к накоплению субстратов ABCB1 белка в культуре клеток MCF-7 вследствие снижения его экспрессии [9]. При моделировании на мышах стрептозоцин-индуцированного СД 1-го типа отмечалось выраженное уменьшение функциональной активности и экспрессии P-gp [10]. Показано увеличение экспрессии белка-транспортера в капиллярах полосатого тела при моделировании СД 2-го типа у мышей [11]. В исследованиях in vitro на клетках линий Сасо-2 и MCF-7 выявлено увеличение функциональной активности и экспрессии P-gp в условиях низкого уровня глюкозы [12; 13]. Вероятно, в регуляции функционирования ABCB1 белка принимает участие цАМФ-зависимая протеинкиназа А, активность которой снижается при высоком уровне глюкозы [13]. В опытах in vitro установлено, что инсулин индуцирует экспрессию P-gp в гепатоцитах и эндотелиоцитах микрососудов головного мозга посредством активации транскрипционного фактора NF-kB через Raf-1 киназу [14]. В исследованиях in vivo и in vitro отмечались изменения функциональной активности и экспрессии P-gp у крыс и мышей со стрептозоцин-индуцированным СД 1-го типа [10; 15]. Учитывая вышеизложенное, ингибирование АВСВ1-белка при аллоксан-индуцированном СД 2-го типа могло быть связано со снижением уровня инсулина и повышением содержания глюкозы крови, что подтверждает результаты, полученные в других исследованиях, выполненных in vitro и на других видах животных. Выводы 1. Однократное внутривенное введение кроликам раствора аллоксана моногидрата (80 мг/кг) вызывает достоверное уменьшение уровня инсулина на 45-й минуте после глюкозной нагрузки и инсулиногенного индекса, а также повышение содержания глюкозы на 90-й и 120-й минуте после глюкозной нагрузки и приводит к развитию сахарного диабета 2-го типа. 2. Моделирование аллоксан-индуцированного сахарного диабета 2-го типа у кроликов вызывает ингибирование функциональной активности гликопротеина-Р, определяемой по фармакокинетике маркерного субстрата фексофенадина, и сопровождается снижением экспрессии белка-транспортера в тканях печени, почек и тощей кишки. REFERENCES [1] Yakusheva E.N., Chernykh I.V., Shchulkin A.V. et al. P-Glycoprotein: Structure, Physiological Role and Molecular Mechanisms of Modulation Functional Activity // Uspekhi Fiziologicheskikh Nauk. 2014. V. 45. № 4. P. 89-98. [2] Shchulkin A.V., Yakusheva E.N., Popova N.M. The role of P-glycoprotein in rational pharmacotherapy in cardiology // Rational Pharmacotherapy in Cardiology. 2013. V. 9. № 6. P. 701-707. [3] Gatsanoga M.V., Chernykh I.V., Shchulkin A.V. et al. The method of assessment of drugs belonging to the substrates of P-glycoprotein on female rabbits // «Nauka molodykh» (Eruditio Juvenium). 2016. № 3. P. 5-10. [4] Shukla R., Anand K., Prabhu K.M. et al. Hypoglycaemic effect of the water extract of Ficus bengalensis in alloxan recovered, mildly diabetic and severely diabetic rabbits // Int. J. of Diabetes in Developing Countries. 1994. V. 14. P. 78-81. [5] Management on carrying out preclinical researches of drugs / A.N. Mironov [et al.]. M.: Grif & Co, 2012. V. 1. [6] Yakusheva E.N., Shchulkin A.V., Chernykh I.V. et al. Functional activity of P-glycoprotein during experimental manipulations // I.P. Pavlov Russian Medical Biological Herald. 2014. № 2. P. 74-77. [7] Guidance for Industry Drug Interaction Studies - Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations / U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Rockville, 2012. [8] Molimard M., Diquet B., Benedetti M.S. Comparison of pharmacokinetics and metabolism of desloratadine, fexofenadine, levocetirizine and mizolastine in humans // Fund. & Clin. Pharmacol. 2005. V. 18(4). P. 399-411. [9] Pandey V., Chaube B., Bhat M.K. Hyperglycemia regulates MDR-1, drug accumulation and ROS levels causing increased toxicity of carboplatin and 5-fluorouracil in MCF-7 cells // J. of cell. biochem. 2011. V. 112. № 10. P. 2942-2952. [10] Nawa A. Inducible nitric oxide synthase-mediated decrease of intestinal P-glycoprotein expression under streptozotocin-induced diabetic conditions // Life sci. 2010. V. 86 № 11. P. 402-409. [11] Wu K.C., Pan H.J., Yin H.S. et al. Change in P-glycoprotein and caveolin protein expression in brain striatum capillaries in New Zealand obese mice with type 2 diabetes // Life sci. 2009. V. 85. № 23. P. 775-781. [12] Ledoux S., Yang R., Friedlander G. et al. Glucose depletion enhances P-glycoprotein expression in hepatoma cells role of endoplasmic reticulum stress response // Cancer res. 2003. V. 63. № 21. P. 7284-7290. [13] Li Q., Sai Y., Kato Y. et al. Influence of drugs and nutrients on transporter gene expression levels in Caco-2 and LS180 intestinal epithelial cell lines // Pharmac. res. 2003. V. 274. № 39. P. 27371-27378. [14] Zhou G., Kuo M.T. NF-κB-mediated induction of mdr1b expression by insulin in rat hepatoma cells // J. of Biolog. Chem. 1997. V. 272. № 24. P. 15174-15183. [15] Zhang L., Lu L., Jin S. et al. Tissue-specific alterations in expression and function of P-glycoprotein in streptozotocin-induced diabetic rats // Acta Pharmacol. Sinica. 2011. V. 32. № 7. P. 956-966. © Якушева Е.Н., Титов Д.С., Попова Н.М., Рябков А.Н., 2016

E N Yakusheva

Ryazan state medical university

Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
Ryazan, Russia

D S Titov

Ryazan state medical university

Email: i3762@yandex.ru
Ryazan, Russia

N M Popova

Ryazan state medical university

Email: p34-66@yandex.ru
Ryazan, Russia

A N Ryabkov

Ryazan state medical university

Email: kafedrafarmakologii@mail.ru
Ryazan, Russia

Views

Abstract - 937

PDF (Russian) - 226