COMPARATIVE EVALUATION OF SENSITIVITY OF DIFFERENT TEST FUNCTIONS OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE TO SALTS OF HEAVY METALS

Cover Page

Abstract


The yeast Saccharomyces cerevisiae are convenient eukaryotic model to determining the toxicity of various pollutants, including heavy metals. Most of biotests with the use yeast are based on the determination of the cytotoxic or genotoxic effect of heavy metals. These methods are time consuming, require special laboratory equipment. For develop of new rapid test-reaction used the ability of baker’s yeast S. cerevisiae, as a yeast of fermentation, was used to form a foam on the surface of the fermentation liquid. To conduct the bioassay used a commercial preparation of dry yeast “SAF-Moment” (LLC “SAF-Neva”, Russian Federation), as a fermentable substrate - 2% glucose solution. The toxic effect of heavy metal salts was determined by the suppression of foaming in a yeast suspension after incubation for 15 min. In parallelevaluated the influence of salts of heavy metals on the growth and survival of yeast. Foaming activity of theyeast was more sensitive to the tested toxicants in comparison with the growth function ofyeastand their survival. Mercury chloride exerted a toxic effect on the foaming in the yeast suspension in a concentration of 0,0001, sulfateof copper, chlorideof cadmium, chlorideof cobalt 0,001, sulfateof lead 0,01, sulfateof iron 0,1, sulfateof zinc 1 g/l. Built a series of toxicity of heavy metal salts with respect to the test functions of S. cerevisiae basically coincided. The advantages of the test reaction for suppressing the foaming activity of yeast are technical simplicity, express (a test of response is 15 min), minimal material costs, no need for special microbiological equipment, culture media, maintaining the culture in a viable condition. The proposed reaction can be used as a express bioassay to assess the toxicity of environments contaminated by the pollutants of this class.


Введение Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами возрастает. Тяжелые металлы могут нарушать и биотический круговорот веществ, и представлять опасность для здоровья человека [1-4]. Для оценки токсичности солей тяжелых металлов широко используют различные эукариотические микроорганизмы [5]. Особенно перспективным объектом для биотестирования служат дрожжи S. cerevisiae, которые являются одноклеточными микроорганизмами, обладающими высокой скоростью роста. В то же время, у дрожжей, как у эукариотических организмов, высокая степень гомологии клеточной организации и обмена веществ с высшими эукариотами [6]. Применяют дрожжи и для биотестирования тяжелых металлов. Большинство биотестов основаны на определении цитотоксического и генотоксического эффектов, на подавлении метаболической активности дрожжей [7-10]. Эти приемы биотестирования достаточно трудоемки, требуют специального оборудования и особых условий. Известен биотест с использованием сухих дрожжей S. cerevisiae, в котором в качестве тест-отклика используется изменение удельной электропроводности суспензии дрожжей, возникающей в результате ингибирования процессов ферментации в присутствии токсикантов, в том числе, солей тяжелых металлов [11]. Ранее авторы предлагали применять тест-реакцию, основанную на способности пекарских дрожжей S. cerevisiae, как дрожжей верхового брожения, образовывать пену на поверхности сбраживаемой жидкости [12]. Данная работа была предпринята для того, чтобы сравнить чувствительность разных тест-функций дрожжей S. cerevisiae при тестировании солей тяжелых металлов. Материалы и методы В качестве тест-объекта использовали препарат сухих пекарских дрожжей «Саф-Момент» (ООО «Саф-Нева», Россия) и культуру S. cerevisiae, выделенную авторами из этого препарата. Для проведения исследований брали следующие соли тяжелых металлов (хч): HgCl 2 , CdCl 2 , CoCl 2 , CuSO 4 , Pb(CH 3 COO), Fe 2 (SO 4 ) 3 , ZnSO 4 . При оценке токсичности исследуемых солей тяжелых металлов определяли их влияние на рост S. cerevisiae. Для культивирования дрожжей использовали среду YEPD следующего состава (г/л): глюкоза - 20,0; пептон - 10,04 дрожжевой автолизат - 5,0. В колбах объемом 250 мл готовили по 50 мл жидкой среды YEPD и добавляли в нее соли тяжелых металлов так, чтобы их конечная концентрация в среде составляла: 0,0001; 0,001; 0,01; 1,0 и 10,0 г/л. В качестве контроля брали среду YEPD без добавления солей тяжелых металлов. Среды засевали суспензией S. cerevisiaeв количестве 1% (от общего объема) и инкубировали в стационарных условиях при температуре +30 °С. Количество жизнеспособных клеток дрожжей в средах определяли через 24 ч. Влияние солей тяжелых металлов на выживаемость дрожжей оценивали после 3-часового экспонирования дрожжевых суспензий с добавлением 0,0001-10 г/л тестируемых токсикантов [13]. Количественный учет жизнеспособных клеток дрожжей осуществляли по методу Коха. При исследовании действия солей тяжелых металлов на длительность lag-фазы S. cerevisiae измеряли оптическую плотность культуральной жидкости через каждые 30 мин в течение 12 ч. Воздействие исследуемых солей тяжелых металлов на пенообразующую активность S. cerevisiae определяли по авторскому экспресс приему [12]. Для этого в 20 мл раствора исследуемой соли тяжелого металла вносили 1,36 г сухих дрожжей, тщательно перемешивали и добавляли 0,4 г глюкозы. Приготовленную реакционную смесь разливали по 3 мл в мерные пробирки объемом 10 мл каждая, инкубировали в течение 15 мин при температуре +20°С, затем определяли объем образовавшейся пены. Контролем служила суспензия дрожжей с глюкозой без внесения солей тяжелых металлов. Все эксперименты проводили не менее чем в 5 независимых опытах с 3-6 параллельными измерениями в каждом. Для статистической обработки полученных данных использовали пакет программ Microsoft Excel. Выводы сделаны с вероятностью безошибочного прогноза Р - 0,95. Достоверность различия результатов определяли с помощью критерия Стьюдента. Результаты и их обсуждение Изучение влияния солей тяжелых металлов на течение лаг-фазы S. cerevisiae показало следующее. В присутствии 0,01 г/л хлорида кадмия ее длительность увеличивалась на 3 ч, 0,1 г/л хлорида кобальта - на 4 ч, 1 г/л сульфата цинка - на 2 ч по сравнению с контролем. Хлорид ртути при содержании 0,0001-0,01 г/л, сульфат цинка - 0,0001-0,1 г/л не оказывали влияния на продолжительность лаг-фазы. Повышение концентрации хлорида ртути до 0,1 г/л, асульфата меди до 1 г/л приводило к подавлению роста культуры. Сульфат железа при содержании 0,0001-1,0 г/л не влиял на длительность лаг-фазы (рис. 1). При определении количества жизнеспособных клеток дрожжей после 24-часового культивирования в средах YEPD с добавлением солей тяжелых металлов получили следующее. Хлорид ртути и сульфат меди начинали подавлять рост при содержании 0,001 г/л, сульфат железа - 0,01 г/л, хлорид кадмия и хлорид кобальта - 0,1 г/л (рис. 2). Следует отметить, что в присутствии 0,0001 г/л сульфата железа и хлорида кобальта отмечали незначительное стимулирующее воздействие на рост S. cerevisiae. Ацетат свинца в диапазоне концентраций до 1 г/л не подавлял роста культуры дрожжей, при содержании 0,0001; 0,001 и 0,01 г/л стимулировал их рост (см. рис. 2). После 3-часового экспонирования дрожжей в растворах тестируемых солей тяжелых металлов достоверное снижение количества жизнеспособных клеток отмечали в присутствии 0,01 г/л хлорида ртути, 0,1 г/л сульфата медии хлорида кадмия, 1 г/л ацетата свинца и хлорида кобальта. При этом численность дрожжей была ниже, чем в контроле в 2,7; 2,2; 2,8; 9,7 и 8,8 раз, соответственно. В растворах сульфата железа с концентрацией 0,0001-10 г/л количество клеток достоверно не отличалось от контроля (рис. 3). Наиболее чувствительной к солям тяжелых металлов оказалась пенообразующая активность S. cerevisiae. Хлорид ртути подавлял пенообразование в дрожжевой суспензии в концентрации 0,0001 г/л, при этом объем образовавшейся пены был на 56,3% меньше, чем в контроле (рис. 4). Сульфат меди, хлорид кадмия и хлорид кобальта оказывали токсическое действие на процесс пенообразования при содержании 0,001 г/л, снижая его интенсивность на 41,5; 25,0 и 21,0% по сравнению с контролем, соответственно (см. рис. 4). Токсический эффект ацетата свинца отмечали при содержании 0,01 г/л, сульфата железа - 0,1 г/л, сульфата цинка - 1 г/л. При этом объем пены был на 34,6; 20,7 и 25,0% меньше, чем в контроле, соответственно (см. рис. 4). Время инкубирования, ч контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0 5 10 15 20 25 контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 -2 3 8 13 контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 0 2 4 6 8 10 контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 2 4 6 8 10 контроль 0,0001 г/л 0,001 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 1 г/л Оптическая плотность суспензии, о.е. Время инкубирования, ч 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 аб Оптическая плотность суспензии, о.е. Время инкубирования, ч Оптическая плотность суспензии, о.е. Время инкубирования, ч вг Оптическая плотность суспензии, о.е. Время инкубирования, ч Оптическая плотность суспензии, о.е. Время инкубирования, ч де Рис. 1. Влияние CdCl 2 (А) и HgCl 2 (B), CuSO 4 (С),CoCl 2 (D), ZnSO 4 (E) и Fe 2 (SO 4 ) 3 (F) на продолжительность лаг-фазы роста дрожжей S. cerevisiаe (Fig. 1. Effect of CdCl 2 (A) and HgCl 2 (B), CuSO 4 (C), CoCl 2 (D), ZnSO 4 (E), and Fe 2 (SO 4 ) 3 (F) on the duration of the growth phase of yeast S. cerevisiae) Концентрация соли тяжелого металла, г/л CdCl 2 HgCl 2 СоCl 2 Fe 2 (SO 4 ) 3 CuSO 4 Pb(C 2 H 3 O 2 ) 2 исходное количество клеток Рис. 2. Влияние солей тяжелых металлов на рост культуры S. cerevisiae (Fig. 2. Effect of heavy metal salts on the growth of S. cerevisiae) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CoCl 2 HgCl 2 Pb(CH 3 COO) 2 CuSO 4 CdCl 2 Fe 2 (SO 4 ) 3 контроль 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 Количество жизнеспособных клеток, 10 6 , кое/мл Концентрация соли тяжелого металла, г/л Рис. 3. Влияние солей тяжелых металлов на выживаемость S. cerevisiae (Fig. 3. Effect of heavy metal salts on the survival of S. cerevisiae) Проведенные исследования показали, что существует чувствительность к солям тяжелых металлов пенообразующей активности S. cerevisiae выше, их ростовой функции и выживаемости. По уменьшению чувствительности к используемым солям тяжелых металлов исследуемые тест-функции дрожжей располагаются в следующем порядке: пенообразующая активность > рост > выживаемость - продолжительность лаг-фазы. Вместе с этим, ряды токсичности солей тяжелых металлов во многом совпадают: - пенообразующая активность - HgCl 2 ; CuSO 4 ; CdCl 2 ; CoCl 2 ; Pb(CH 3 COO) 2 ; Fe 2 (SO 4 ) 3 ; ZnSO 4 ; - рост - HgCl 2 ; CuSO 4 ; CdCl 2 ; Fe 2 (SO 4 ) 3 ; СоCl 2 ; Pb(CH 3 COO) 2 ; - выживаемость - HgCl 2 ; CuSO 4 ; CdCl 2 ; CoCl 2 , Pb(CH 3 COO) 2 ; Fe 2 (SO 4 ) 3 ; - продолжительность лаг-фазы - CdCl 2 ; HgCl 2 ; CoCl 2 ; CuSO 4 ; ZnSO 4 ; Fe 2 (SO 4 ) 3 . Рис. 4. Влияние солей тяжелых металлов на пенообразование в суспензии дрожжей с глюкозой (Fig. 4. Effect of heavy metal salts on foaming in a suspension of yeast with glucose) Как видно из приведенных данных, повышенной токсичностью по отношению к пекарским дрожжам S. cerevisiae обладают хлорид ртути, сульфат меди, хлорид кадмия. Близкие результаты по влиянию этих солей на жизнеспособность дрожжей показаны и в работах других авторов [7; 14-18]. Биотест по определению пенообразующей активности S. cerevisiae наряду с более высокой чувствительностью отличается меньшими временными и материальными затратами. Время тест-отклика составляет 15 мин. Метод не требует специального микробиологического оборудования и питательных сред. Нет необходимости в поддержании культуры в жизнеспособном состоянии, так как для проведения тест-реакции используются коммерческие препараты сухих дрожжей. Заключение Таким образом, тест-реакция по подавлению пенообразующей активности пекарских дрожжей S. cerevisiae более чувствительна к солям тяжелых металлов по сравнению с ростовой функцией дрожжей и их выживаемостью. Она выгодно отличается технической простотой и может быть использована в качестве экспрессного биотеста для оценки токсичности сред, загрязненных поллютантами этого класса.

O F Vyatchina

Irkutsk State University

Author for correspondence.
Email: olgairk3@rambler.ru
Karl Marx str., 1, Irkutsk, Russia, 664003

Vyatchina Olga Fedorovna - Candidate of Biological Sciences, Associate Professor, Department of Microbiology, Biology and Soil Faculty, Federal State Budget Educational Institution of Higher Education “Irkutsk State University”.

G O Zhdanova

Irkutsk State University

Email: zhdanova86@yandex.ru
Karl Marx str., 1, Irkutsk, Russia, 664003

Zhdanova Galina Olegovna - Junior Researcher of the Laboratory of Water Toxicology, Scientific Research Institute of Biology, Federal State Budget Educational Institution of Higher Education “Irkutsk State University”.

D I Stom

Irkutsk State University

Email: stomd@mail.ru
Karl Marx str., 1, Irkutsk, Russia, 664003

Stom Devard I. - Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Laboratory of Water Toxicology of the Scientific Research Institute of Biology, Professor of the Department of Zoology of Vertebrates and Ecology of the Biology and Soil Faculty, Federal State Budget Educational Institution of Higher Education “Irkutsk State University”; Professor of the Department of Engineering Communications and Life Support Systems of the Irkutsk National Research Technical University; Chief scientist of the Baikal Museum of the Irkutsk Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences.

  • Sharma В., Singh S., Siddiq N.J. Biomedical Implications of Heavy Metals Induced Imbalances in Redox Systems // BioMed Research International. 2014. Р. 1—26. http://dx.doi.org/10.1155/2014/640754
  • Tchounwou P.B., Yedjou C.G., Patlolla A.J., Sutton D.J. Heavy Metals Toxicity and the Environment // Molecular, Clinical and Environmental Toxicology. 2012. Vol. 101. Р. 133—164. doi: 10.1007/978-3-7643-8340-4_6.
  • Vries W., Groenenberg J.E., Lofts S., Tipping E., Posch M. Critical Loads of Heavy Metals for Soils // Heavy Metals in Soils. 2012. Vol. 22. Р. 211—237. doi: 10.1007/978-94-007-4470-7_8.
  • Filenko O.F., Dmitrieva A.G., Isakova E.F., Ipatova V.I., Prokhotskaya V.Yu., Samoylova T.A., et al. Mechanisms of the reaction of aquatic organisms to the action of toxic substances: in the book: Anthropogenic Influences on Water Ecosystems (Collection of Articles). M.: The scientific publications of the KMC, 2005. P. 70—93.
  • Gutierrez J.C., Amaro F., Martin-Gonzalez A. Heavy metal whole-cell biosensors using eukaryotic microorganisms: an updated critical review // Frontiers in Microbiology. 2015. Vol. 6. doi: 10.3389/fmicb.2015.00048.
  • Ludwig J., Schmitt M., Lichtenberg-Fraté H. Saccharomyces cerevisiae as Biosensorfor Cyto- and Genotoxic Activity // Atmospheric and Biological Environmental Monitoring. 2009. P. 251—259. doi: 10.1007/978-1-4020-9674-7_17.
  • Hosiner D., Gerber S., Lichtenberg-Frate H., Glaser W, Sch ller C., Klipp E. Impact of Acute Metal Stress in Saccharomyces cerevisiae // PLoS One. 2014; 9(1): e83330. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083330
  • Bao S., Lu Q., Fang T., Dai H., Zhanga С. Assessment of the Toxicity of CuO Nanoparticles by Using Saccharomyces cerevisiae Mutants with Multiple Genes Deleted // Appl. Environ. Microbiol. 2015. Vol. 81. No. 23. P. 8098—8107. doi: 10.1128/AEM.02035-15.
  • Nakamura H., Suzuki M. New concept for a toxicity assay based on multiple indexes from the wave shape of damped metabolic oscillation induced in living yeast cells (part II): application to analytical toxicology // Anal Bioanal Chem. 2007; 389(4): 1233—1241. PubMed PMID: 17717646. doi: 10.1007/s00216-007-1513-7.
  • Starodub N.F., Guidotti M., Shavanova K.E., Taran M.V., Son’ko R.V. Ways for the Control of the Total Toxicity of Environmental Objects and their Instrumental Providing // Biosensore & Bioelectronics. 2015. 6:3, doi.org/10.4172/2155-6210.1000180
  • Dolezalova J., Rumlova L. A new biological test of water toxicity-yeast Saccharomyces cerevisiae conductometric test // Environ. Toxicol Pharmacol. 2014. 38(3): 977—81. http://doi.org/10.1016/j.etap.2014.10.009
  • Vyatchina O.F., Zhdanova G.O., Stom D.I. Express reception of biological analysis of water quality with the help of Saccromycetes // Natural Sciences. 2009. № 4. P. 133—136.
  • Pavlenko V.V., Demidova L.A., Trubacheva L.Ya., et al. A Method for Estimation of Toxicity and Mutagenicity of Wastewater and Chemical Compounds // Methods for Biotesting Waters. Chernogolovka, 1988. P. 73—77.
  • Kalyuzhin V.A., Kalyuzhina O.V. The influence of concentrated solutions of salts of heavy metals on the physiological and kinetic indices of microorganisms // Vestn. Tomsk State University. 2007. № 298. P. 218—222.
  • Balaeva-Tikhomirova O.M., Novikova A.S., Kublitskaya A.D. Effect of heavy metal salts and an extract with an antioxidant effect on the parameters of protein metabolism of yeast cells // Journal VDU. 2016. No. 3 (92). P. 16—25.
  • Fetisova A.V., Ilarionov S.A. The content of free amino acids in the culture medium of yeast Saccharomyces cerevisiae growing at different copper concentrations // Privolzhsky scientific bulletin. 2013. No. 11 (27). P. 47—50.
  • Muthukumar K., Nachiappan V. Cadmium-induced oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae // Indian J. Biochem Biophys. 2010. 47(6): 383—7.
  • Oliveira R.P., Basso L.C., Junior A.P., Penna T.C., Del Borghi M., Converti A. Response of Saccharomyces cerevisiae to cadmium and nickel stress: the use of the sugar cane vinasse as a potential mitigator // Biol Trace Elem Res. 2012 Jan; 145(1): 71—80. doi: 10.1007/s12011-011-9156-0.

Views

Abstract - 133

PDF (Russian) - 521


Copyright (c) 2017 Vyatchina O.F., Zhdanova G.O., Stom D.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.