SELECTION OF GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID PRODUCING LACTOBACILLUS AND BIFIDOBACTERIUM SYMBIONT STRAINS AS POTENTIAL PSYCHOBIOTICS

Abstract


Gamma-amino butyric acid (GABA) is an active biogenic substance, synthesized in the organisms of plants, fungi, vertebrate animals and bacteria. GABA is used in food and drugs exhibiting antihypertensive, analgesic and antidepressant properties. GABA-producing strains can be considered as delivery vehicles of GABA to specific sites of the gut. Such strains are potential antidepressants promoting adaptation in the extreme north. Lactic acid bacteria (LAB) are considered the main producers of GABA among bacteria. GABA-producing Lactobacilli are isolated from food products such as cheese, yogurt, sourdough etc. and are the source of bioactive properties assigned to those foods. The ability of Human-derived Lactobacilli and Bifidobacteria to synthesize GABA remains poorly characterized. In this paper, we screened our collection of 114 Human-derived Lactobacillus and Bifidobacterium strains for their ability to produce GABA from its precursor monosodium glutamate (MSG). As a result 58 strains belonging to the species L.plantarum , L.brevis , B.adolescentis , B.angulatum , B.dentium were able to produce GABA. The most efficient GABA-producers were Bificobacterium strains (up to 6 g/L). We selected a GABA-producing strains that was further tested in Sprague-Dawley rats. Ingestion of L.plantarum 90sk strain increased GABA in the rats’ blood and decreased the rate of stress hormone prolactin.

Стрессы при продолжительном воздействии на организм человека приводят к развитию ряда неврологических заболеваний, в частности депрессии и тревож- ным расстройствам [16]. Экологические стрессоры (низкие температуры, изме- нение фотопериодизма, магнитного поля и излучения), характерные для Край- него Севера, являются одной из причин развития у человека так называемого синдрома полярного напряжения. Это состояние характеризуется глубокими на- рушениями процессов на клеточном уровне и выражается утомляемостью, на- рушением сна, депрессией, тревожным состоянием и др. Депрессивное состояние сопровождается рядом физиологических изменений: активизацией вегетативной нервной системы, изменением гормонального статуса, активизацией гипотала- мо-гипофизарно-адреналовой системы, изменениями в составе кишечной микро- биоты, увеличением количества адреналина, снижением активности ГАМК- рецепторов, снижением количества инсулина в крови [1].51Вестник РУДН, серия Экология и безопасность жизнедеятельности, 2016, № 4Применение лекарств-антидепрессантов, несмотря на их эффективность, име- ет ряд недостатков: эффект привыкания, побочные эффекты. Поиск новых ле- карственных средств крайне важен. Такими принципиально новыми лекарствен- ными средствами являются пробиотические бактерии, преимущественно лакто- бациллы и бифидобактерии, в достаточных количествах способные оказывать благоприятное воздействие на здоровье пациентов. Пробиотики все чаще ис- пользуются в комбинированном лечении начальных стадий различных сомати- ческих заболеваний [2]. Преимуществом использования пробиотиков в качестве лекарственных средств является их относительная безвредность и физиологич- ность по сравнению с химическими препаратами.Совокупность населяющих тело человека микроорганизмов (преимуществен- но бактерий) - микробиом (микробиота) - играет чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности организма [18]. Бактерии кишечного микробиома участвуют не только в регуляции общего метаболизма и иммунитета, но и в функциониро- вании нервной системы хозяина [5; 14]. Кишечный микробиом рассматривается в настоящее время как часть так называемой оси «кишечник - мозг (gut - brain axis)» - двунаправленной коммуникационной системы, обеспечивающей слож- ное функционирование ЦНС и ЖКТ [9; 10]. Отдельные штаммы пробиотических бактерий способны положительно влиять на эмоциональное поведение, воспри- ятие боли, стресса у лабораторных животных [4]. Есть данные о подобном действии пробиотиков, так называемых психобиотиков на людей [8; 13; 15]. Взаимодей- ствие бактерий кишечной микробиоты и нервной системы организма-хозяина осуществляется посредством синтезируемых бактериями низкомолекулярных веществ, нейромедиаторов и гормоноподобных веществ; к ним относятся аце- тилхолин и другие холины, серотонин, норадреналин, гистамин и другие амины, жирные кислоты с короткими цепями, гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) [10]. Секретируемые бактериями нейротрансмиттеры могут непосредственно дей- ствовать на нервные окончания в ЖКТ, а также стимулировать эпителиальные клетки кишечника, которые в ответ высвобождают молекулы, модулирующие нейропередачу в энтеральной нервной системе, оказывая влияние на мозг и по- ведение человека. Такого рода бактерии следует рассматривать как систему до- ставки нейроактивных соединений в нужное место (клетки энтеральной нервной системы), обладающую профилактическим и терапевтическим потенциалом в отношении неврологических и нейрофизиологических расстройств.Материалы и методыШтаммы бактерий и условия культивирования. В работе были использованы 114 штаммов 16 видов лактобацилл и бифидобактерий, выделенных из фекалий, слюны и вагинального содержимого жителей центрального региона РФ, а также 3 штамма из коллекции ATCC. Лактобациллы и бифидобактерии выращивали в жидкой и на агаризованной среде MRS [6] при 37 °С в течение 24-48 час. в ана- эробных условиях, обеспечивающих атмосферу, содержащую 10% СО2 (HiAnaerobic System - Mark III, HiMedia, India). Для бифидобактерий в среду добавляли 0,05% цистеина. При проверке способности штаммов к синтезу ГАМК в среду добав-52Юнес Р.А., Полуэктова Е.У., Дьячкова М.С. и др. Отбор бактерий-симбионтов рода Lactobacillus...ляли 1% предшественника ГАМК мононатриевой соли глютаминовой кислоты. PLP добавляли в MRS в концентрации 0,5 мМ.Тонкослойная хроматография и определение количества ГАМК. Для разделения аминокислот в культуральной жидкости штаммов и идентификации ГАМК про- водили тонкослойную хроматографию на стеклянных пластинах со слоем сили- кагеля (TLC plates Silica gel 60 F254 Merck, Germany). В качестве растворителя использовали н-бутанол, уксусную кислоту и воду (4:1:1). Нингидрин добавляли в элюирующую смесь в концентрации 0,2%. Для измерения количества ГАМК в образцах использовали двумерное сканирование пластинок на денситометре Shimadzu CS-930, Japan (λ = 512).Опыты на крысах линии Спрэг-Доули. Опыты на животных проводили на кры- сах линии Спрэг-Доули; штаммом сравнения был пробиотический штамм L.rhamnosus GG, неспособным к синтезу ГАМК. В течение 15 дней 3 группы крыс (по 10 крыс в группе) получали соответственно стерильную питательную среду MRS, пробиотичесикй штамм L.rhamnosus GG и штамм L.plantarum 90sk. Первые две группы служили контролем. Бактериальные штаммы вводили ежедневно кры- сам через зонд в количестве 109 степени КОЕ. Стрессовым фактором служил хо- лодовой шок, индуцированный у крыс в результате снижения температуры до-40 °С в течение 45 сек. в последние 10 дней опыта. После этого крыс умерщвляли и удаляли из них кровь для измерения в ней уровня ГАМК и гормона стресса про- лактина.Результаты и обсуждениеИспользуя хроматографию на силикагеле, мы проверили коллекцию из 13 ви- дов лактобацилл и 3 видов бифидобактерий, выделенных из организма людей, на способность синтезировать и секретировать в среду ГАМК (табл. 1). Способностью секретировать ГАМК обладали 58 штаммов из 114 проверенных. Эта способность была видоспецифична, ею обладали виды L.plantarum, L.brevis и B.adolescentis, B.angulatum, B.dentium. Из 21 проверенного штамма L.fermentum, 28 штаммов L.rhamnosus и 11 штаммов L.casei ни один не секретировал ГАМК; не секретиро- вали ГАМК и единичные проверенные штаммы L.buchneri, L.helveticus, L.salivarius, L.sakei, L.reuteri, L.mucosa, L.crispatus, L.gasseri.Таблица 1Скрининг штаммов лактобацилл и бифидобактерий, способных к синтезу ГАМКВид лактобацилл и бифидобактерииКоличество проверенных штаммовКоличество штаммов-продуцентов ГАМКL. fermentum210L. rhamnosus280L. plantarum3030L. brevis33L. casei110L. helveticus20L. salivarius40L. sakei10L. reuteri30L. mucosa1053Вестник РУДН, серия Экология и безопасность жизнедеятельности, 2016, № 4Окончание табл. 1Вид лактобацилл и бифидобактерииКоличество проверенных штаммовКоличество штаммов-продуцентов ГАМКL. crispatus20L. buchneri30L. gasseri10B. adolescentis2121B. angulatum33B. dentium11Total11458Концентрация ГАМК в среде роста колебалась от 50 до 6000 мкг/мл. У лакто- бацилл она была больше у штаммов L.brevis (до 675 мкг/мл), чем у L. plantarum (до 300 мкг/мл); у бифидобактерий она была значительно выше (2500-6000 мкг/ мл) (табл. 2).Таблица 2Определение количества ГАМК, синтезируемой лактобациллами и бифидобактериямиВиды бактерийШтаммыУровень ГАМК, μg/млLactobacillus plantarum29st, 50/2, k13, 75sk, 14/4, 36st, 19/1A, 106zv,38/1До 5046sk, 3/1, 7/1, 52/1, CS396, K9L, 50st3, 43/3,119, 43/2, 56/151-1008-PA-3, 46k, 42/2, 191g, 57/1101-15043/5, 32sk, 43/4, 90sk, 29sk151-300Lactobacillus brevis47st,52st,50-10015f675Bifidobacterium adolescentis56, 174, 191, 104, 76,S11До 900108, 282, 48-2, 110, 44, S14, km4, 277, 44-2901-300057, 48, Tv29, km5-1, 152, 1503001-6000Bifidobacterium angulatum334-1, 212, GT1022616-3469Bifidobacterium dentium92465Лактобациллы, выделенные из продуктов питания (сыров, йогуртов, заквасок, традиционных продуктов корейской и китайской кухонь kimchi и paocai), демон- стрировали высокий уровень синтеза ГАМК. Максимальное количество ГАМК - 129 г/л - было получено у штамма L.buchneri WP2001 [19]. Для L.brevis макси- мальное количество ГАМК демонстрировали штаммы NCL912 и K203, 35,6 и 44,4 г/л соответственно [11; 19]. Для L.plantarum наибольшее количество ГАМК составило 0,5 г/л [3] и 1,16 г/л для штамма, содержащего дополнительный кло- нированный на плазмиде ген gadB [17]. Продукция ГАМК штаммами лактобацилл и бифидобактерий, выделенными из организма человека, была описана только в статье Barrett et al., 2012 и составила 32 г/л для L.brevis и 2,0-8,6 г/л для B.infantis, B.angulatum, B.dentium. Среди выделенных нами штаммов наблюдался значитель- ный разброс в количестве синтезируемой ГАМК. Для L.plantarum эти цифры были сходны с теми, которые были получены для штаммов, выделенных из продуктов питания, для L.brevis они были ниже; наибольшее количество ГАМК продуциро- вали штаммы бифидобактерий (B.angulatum, B.adolescentis, B.dentium) - до 6 г/л.54Юнес Р.А., Полуэктова Е.У., Дьячкова М.С. и др. Отбор бактерий-симбионтов рода Lactobacillus...На основе способности синтезировать ГАМК и других пробиотичнеских свой- ствах (антагонистическая, антиоксидантная активность) был отобран штамм L.plantarum 90sk. Для проверки предполагаемого антидепрессивного эффекта ГАМК-продуцирующего штамма L.plantarum 90sk были проведены опыты на кры- сах линии Спрэг-Доули (см. Материалы и методы, рис. 1).Рис. 1. Схема опыта по определению влияния штаммаL.plantarum 90sk на крыс в условиях холодового шокаμ mol/L2,521,510,5p < 0,05p < 0,010MRS L.rhamnosus GG L.plantarum 90skРис. 2. Количество ГАМК в крови крыс Спрэг-Доули по окончании опытаУровень ГАМК в крови крыс, получавших ГАМК-продуцирующий штамм, был достоверно выше по сравнению с двумя контрольными группами (MRS и L.rhamnosus GG) (см. рис. 2).55Вестник РУДН, серия Экология и безопасность жизнедеятельности, 2016, № 4Количество измеренного гормона стресса пролактина в крови крыс, получав- ших штамм L.plantarum 90sk, было достоверно ниже, чем у крыс, получающих стерильную среду MRS и штамм L.rhamnosus GG (рис. 3).ng/ml 16p < 0,0514121086420p < 0,05MRS L.rhamnosus GG L.plantarum 90skРис. 3. Количество пролактина в крови крыс Спрэг-Доули по окончании опытаУвеличение содержания ГАМК в крови крыс опытной группы свидетельству- ет о том, что штамм L.plantarum 90sk синтезировал ГАМК в кишечнике, которая затем попала в русло крови. Снижение уровня пролактина в крови крыс опытной группы говорит об адаптации крыс к стрессу, что хорошо описано в литературе [12]. Штамм L.plantarum 90sk является потенциальным психобиотиком, способ- ным облегчить синдром полярного напряжения, тем самым способствуя адапта- ции человека в условиях Крайнего Севера.

R A Yunes

Vavilov Institute of General Genetics; Peoples’ Friendship University of Russia

Gubkin str., 3, Moscow, Russia, 119991; Podolskoe shosse, 8/5, Moscow, Russia, 113093

E U Poluektova

Vavilov Institute of General Genetics

Gubkin str., 3, Moscow, Russia, 119991

M S Dyachkova

Vavilov Institute of General Genetics

Gubkin str., 3, Moscow, Russia, 119991

Y E Kozlovski

Research Institute of Human Morphology

Tsyurupy str., 3, Moscow, Russia, 117418

V S Orlova

Peoples’ Friendship University of Russia

Podolskoe shosse, 8/5, Moscow, Russia, 113093

V N Danilenko

Vavilov Institute of General Genetics

Gubkin str., 3, Moscow, Russia, 119991

Views

Abstract - 99

PDF (Russian) - 108


Copyright (c) 2016 Юнес Р.А., Полуэктова Е.У., Дьячкова М.С., Козловский Ю.Е., Орлова В.С., Даниленко В.Н.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.