SHORT PEPTIDES REGULATE THE GROW OF CALLUS CULTURE TOBACCO NICOTIANA TABACUM L

Cover Page

Abstract


Phytohormones, which are secreted peptides, play an important role in intercellular inter-actions, participating in the regulation of development and in numerous physiological processes and in responses to the influence of environmental factors. Short peptides in a concentration of 10-7-10-8 M regulate the growth and development of the callus culture of tobacco (Nicotiana tabacum L.) in culture in vitro. AlaGluAspGly, AlaAspGluLeu, GlyGly and GlyAsp on the 28th day of cultivation showed an increase in the biomass of tobacco by a factor of 1.5 to 2.5, an increase in the number of regenerants per explant by 10-30%, and also the area of the leaf plate of regenerants by 2-2.5 times. Exogenous peptides influence the expression of genes encoding the proteins of growth factor regulators. It was found that the expression values calculated by the PCR-PB method depend on the nature of the peptide. In addition, structurally different peptides differentially affect the different genes (growth regulating factor) of GRF. The greatest increase in the expression level of GRF family genes is observed in the presence of AlaAspGluLeu - GRF1, GRF3, GRF4 3.5-4 times, in the presence of AlaGluAspGly - GRF2 more than 4.5 times, GlyGly - GRF4 more than 3 times, GlyAsp - GRF3, GRF4 in 3-4 times. It is assumed that in the cell culture, short peptides can act as a regulator of the growth of new generation plants that can find application in biotechnology and practical plant growing.


Важнейшей задачей агробиотехнологии является увеличение продуктивности сельскохозяйственных культур. Наиболее эффективным способом решения этой задачи является создание высокопродуктивных сортов растений, что является весьма трудоемким и дорогостоящим процессом. Альтернативным подходом могли бы стать трансгенные высокоэффективные сорта, которые в настоящее время не получили достойного применения в сельском хозяйстве. Таким образом, для агробиотехнологии наиболее приемлемым подходом остается создание технологии использования разнообразных биологически активных веществ, гормонов с целью увеличения продуктивности и повышения урожайности сельскохозяйственных культур [1]. Пептиды образуют обширную и многообразную сигнальную регуляторную систему, контролирующую физиологию, рост и развитие животных и растений [2, 3]. Большинство известных эндогенных пептидов - это гормоны (нейропептиды, гормоны роста). Фитогормоны, представляющие собой секретируемые пептиды, играют важную роль в межклеточных взаимодействиях, участвуя в регуляции развития и в многочисленных физиологических процессах и в ответах на воздействие окружающих факторов. Наиболее изученным семейством секретируемых пептидов в растениях является семейство CLE-CLAVATA3/endosperm surrounding region related [4, 5]. Эти пептиды взаимодействуют с сигнальными фитогормонами и могут участвовать в регуляции, модулируя широкий круг биологических процессов. Установлено, что CLE пептиды направленно влияют на процессы развития семени, закладку и образование сосудистых тканей, инициации закладки придаточных корней, а также в регуляции гомеостаза стволовых клеток в апикальной меристеме проростков и корней. О действии экзогенных коротких пептидах на растительные клетки данные практически отсутствуют [6]. Целью данной работы явилось изучение действия коротких пептидов - AlaGluAspGly, AlaAspGluLeu, GlyGly и GlyAsp на каллусную культуру табака (Nicotiana tabacum L.). ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Тетрапептиды AlaGluAspGly и AlaAspGluLeu были синтезированы в Санкт- Петербурском институте биорегуляции и геронтологии. Дипептиды GlyGly и GlyAsp - фирмы «Serva», США. В качестве объекта исследования использовали табак Nicotiana tabacum L. сорт Samsun Sn-1. В качестве эксплантов использовали семядольные листья проростков. Растения культивировали на агаризованной среде Мурасиге-Скуга (MC) [7] с добавлением к ней следующих биологически активных веществ: 6-бензиламинопурин 2 мг/л и индолилуксусная кислота 0,2 мг/л. Семена стерилизовали в растворе гипохлорита натрия в течение 15 мин с последующей 3-кратной промывкой стерильной водой. Затем семена помещали на безгормональную агаризованную питательную среду в чашки Петри и проращивали в течение 10 дней при температуре 24 С. После прорастания семядоли помещали на питательную среду, содержащую гормоны с добавлением пептидов в концентрации 10 -7 М, после стерилизации фильтрованием. Данная концентрация, как оптимальная для применения в культуре in vitro, была выбрана по результатам предыдущих экспериментов [6]. Условия культивирования: в световой комнате при температуре 26 С, освещение люминесцентными лампами (5000 Люкс, фотопериод 16 часов). Изменения в развитии фиксировались еженедельно. Опыты проводился в течение 4 недель в 4-х повторностях. РНК выделяли по стандартному методу с использованием наборов реагентов для выделения РНК «РНК-Экстран» ООО Синтол (Россия). Концентрацию выделенных препаратов определяли спектрофотометрически. кДНК получали по стандартной методике, используя набор реагентов для проведения обратной транскрипции ООО Синтол (Россия). Гены семейства GRF(growth regulating factor) из N. tabacum L. были найдены в базе данных NCBI. Праймеры к генам были оптимизированы по базе данных NCBI. Подобранные праймеры были синтезированы в ООО Синтол. Все праймеры представлены в табл. 1. Таблица 1 Праймеры к GRF генам Nicotiana tabacum L. Наименование 3’5 ’последовательность Кодируемый белок GRF1 ccc gga ttc cca act aca ca agc gcg tgt act tca cta ctt DNA(apurinic or apyrimidinic site) lyase 2like GRF2 cat cca gca gtg cac aga ga ctt cct gag acc gag cag tg DNA topoisomerase 3alphalike GRF3 tac gaa ctg tga ggc atc cg ttc acc act caa tgt gcc gt 3'5' exoribonuclease 1like GRF4 gac gaa gag gaa ggc ttg ga gcc gta ctc cca tca gct tt endonuclease 8like 3 Реакцию П ЦР в реальном времени проводили в термоциклере CFX 96 Real- Time System (BIORAD). Подготовку образцов проводили по стандартному методу с помощью набора реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии Sybr GreenI ООО Синтол. Реакция ПЦР-РВ проводилась в одинаковых условиях для всех образцов: 95С - 5 мин - активация Taq полимеразы, далее 45 циклов - 94 С - 30 сек, 58 С - 30 сек, 72 С - 30 сек. После последнего цикла 72 С - 2 мин. Реакцию ставили в 3-х параллелях и 3-х повторностях. Относительный уровень экспрессии рассчитывали по калибровочной кривой относительно гена Gapdh, сделанной в пяти повторах. Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Exсel. РЕЗУЛЬТАТЫ Растения обладают способностью постоянно продуцировать новые ткани и органы на протяжении всей их жизни. Жизнеспособность растений так сильна, что они могут существовать несколько столетий и даже больше. И этот удивительный факт обусловлен растительными стволовыми клетками. Стволовые клетки растений обеспечивают их обновление и образование из них листьев, стеблей, стволов и цветов. Стволовые клетки репарируют ткани и регенерируют органы. Соотношение между сохранением стволовых клеток и их дифференциацией является основным аспектом для нормального роста и развития растения. Такие элементы - молекулярные регуляторы, как фитогормоны, факторы транскрипции и некоторые другие известные и неизвестные гены кооперируются для реализации этих процессов [8]. В качестве объекта для исследования была выбрана модель регенерации и образования каллусной ткани Nicotiana tabacum L. сорт Samsun Sn-1. В качестве эксплантов использовали семядоли табака. Изучались следующие показатели: скорость образования каллусной массы, количество регенерантов, скорость роста регенерантов, образование листовой системы у регенерантов. Для того чтобы охарактеризовать каллусы, использовали такие показатели, как: плотность, окраску, обводненность и весу сырой каллусной массы. Через 3 недели после помещения экспланта на среду с добавлением пептидов регистрировали частоту каллусогенеза и морфологию образовавшихся каллусов: цвет, текстуру, величину, количество образовавшихся регенерантов и листьев. В конце эксперимента (через 4 недели) отмечали нормально сформировавшиеся растения (регенеранты), имеющие побеги и корневую систему, и отклоняющиеся формы (ризогенез, геммагенез). Эффективность регенерации рассчитывали как процент каллусов, давших нормальные растения-регенеранты от общего количества каллусных линий. Известно, что использование цитокининов вызывает интенсивный каллусогенез. В серии проведенных экспериментов установлено, что пептиды не препятствовали формированию каллуса. Во всех вариантах каллус и регенеранты образовывались у всех эксплантов. Гибели эксплантов нами отмечено не было. Наблюдения, проводившиеся на 7-е сутки, показали более высокую индукцию каллусогенеза с добавлением пептидов в питательную среду во всех вариантах. Наиболее интенсивное каллусообразование наблюдалось на 6-8 сутки под воздействием гормонов в присутствии AlaAspGluLeu в концентрации 10 -7 М. На рисунке 1 представлены характерные фотографии, демонстрирующие процесс каллусообразования и регенерации после 28 суток культивирования на агаризованной среде МС без и в присутствии пептидов. Контрольный каллус имеет более рыхлую структуру, светло-зеленую окраску. Большая часть регенерантов находится в зачаточном состоянии (рис. 1 а-в). Формирующиеся листовые пластинки имели небольшой размер (рис. 1б, табл. 2). В вариантах с применением AlaAspGluLeu были получены наилучшие результаты: каллус имел яркую зеленую окраску, плотную структуру, образовывался равномерно по всему экспланту, а регенеранты выглядели более мощными, их было больше (рис. 1 г-е, табл. 2) и они имели более сформировавшуюся структуру. Листовые пластинки в присутствии пептидов были более крупными (рис. 1, табл. 2). Наибольшим количеством регенерантов было выявлено при культивировании каллусов в присутствии AlaAspGluLeu. Площадь листовых пластинок увеличивалась при воздействии всех изученных пептидов, особенно при добавлении в среду AlaAspGluLeu. Как видно из табл. 2, пептиды влияли на увеличение биомассы в 1,5-2,5 раза. Регенерационный потенциал также был выше в опытных вариантах (табл. 2). Таким образом, присутствие в питательной среде пептидов оказало положительный эффект как на накопление биомассы, так и на регенерационный потенциал - количество и размер регенерантов. Выявлена высокая эффективность AlaAspGluLeu на каллусной культуру табака. Полученные результаты убедительно свидетельствуют о перспективности использования коротких пептидов для улучшения процессов регенерации у растений. Факторы регуляторов роста (GRF) в растениях являются специфическими факторами транскрипции. Их роль была определена в развитии стебля, листьев, цветов и формировании семян, развитии корней и в координации процессов роста во враждебной окружающей среде [9]. Рис. 1. Эффект коротких пептидов на каллусогенез табака Nicotiana tabacum L. после культивирования в течение 28 дней на агаризованной среде МС. Регенерация на среде МС с добавлением 2 мг/л 6 БАП и 0,2 мг/л ИУК без - а-в; с добавлением AlaGluAspGly - г-е; AlaAspGluLeu - ж-и; GlyGly - к-м и GlyAsp - н-п. Первый ряд - общий вид экспланта; второй ряд - регенеранты с крупными листьями; третий ряд - морфогенный каллус Таблица 2 Влияние коротких пептидов на развитие каллусной массы и регенерационный потенциал табака Вариант Вес каллусной массы, мг Число регенерантов на эксплант, шт Площадь листа крупных регенерантов, мм 2 П лощадь листа мелких регенерантов, мм 2 Контроль 297 14 7,8 0,7 6,2 2,0 2,5 1,1 AlaAspGluLeu 698 16 11,2 0,5 15,8 2,2 5,0 1,0 AlaGluAspGly 581 16 9,8 0,6 12,9 1,8 3,8 0,8 GlyGly 462 12 9,0 0,5 12,1 1,4 4,1 0,8 GlyAsp 374 12 9,5 0,5 12,7 2,1 4,0 0,9 Для табака только у четырех генов регуляторов фактора роста (GRF) были определены кодируемые белки. Этот факт явился основным при выборе объектов исследования для изучения их экспрессии под воздействием коротких пептидов. Все кодируемые белки используемых нами генов специфически связываются с ДНК по определенным сайтам. Это ДНК-апуриновая/апиримидиновая лигаза, ДНК-топоизомераза 3,3’,5’-экзонуклеаза и эндонуклеаза 8 (см. табл. 1). Данные по экспрессии генов GRF в каллусной культуре табака, выращенного как в отсутствии, так и в присутствии коротких пептидов, представлены на рис. 2. Рис. 2. Относительный уровень экспрессии генов семейства GRF в каллусах Nicotiana tabacum L., выращенных на питательной среде МС без и в присутствии коротких пептидов: 1 - контроль, 2 - AlaGluAspGly, 3 - AlaAspGluLeu, 4 - GlyGly, 5 - GlyAsp Как сл едует из этого рисунка, тетрапептид Ala-Asp-Glu-Leu увеличивает экспрессию гена GRF1 практически в 4 раза, а три других пептида только незначительно активировали этот ген (1,5раз). Хотя Ala-Asp-Glu-Leu и увеличивают экспрессию гена GRF2, но только в 2 раза, в отличие от тетрапептида AlaGluAspGly, который экспрессирует GRF2 практически в 5 раз. Дипептиды GlyGly и GlyAsp практически не влияли на экспрессию гена GRF2. Все используемые пептиды незначительно влияют на экспрессию гена фактора роста GRF3 и увеличивают уровень экспрессии в 1,5-3 раза. Тетрапептид Ala-Asp-Glu-Leu увеличивает экспрессию гена GRF4 почти в 4 раза, дипептид GlyGly - в 3 раза, а дипептид GlyAsp - почти в 5 раз по сравнению с контролем. Нужно отметить, что присутствие тетрапептида AlaGluAspGly в питательной среде практически не изменило уровень экспрессии гена GRF4. Таким образом, короткие пептиды влияют на экспрессию генов, кодирующих белки регуляторов факторов роста. Величина экспрессии зависит от природы пептида. Кроме того, разные по структуре пептиды по-разному влияют на разные гены GRF. Эти данные могут указывать на то, что короткие пептиды, связываясь с определенными промоторными участками ДНК, могут регулировать экспрессию генов, подобно действию растительных гормонов [10]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, короткие экзогенные пептиды могут являться регуляторами роста, развития и клеточной дифференцировки, целенапрвленно влияя на экспрессию определенных генов. Мы предполагаем, что короткие пептиды могут действовать в клеточной культуре как регуляторы роста растений нового поколения, которые могут найти применение в биотехнологии и практическом растениеводстве. Работа была выполнена с использованием оборудования Центра коллективного пользования ФГБНУ ВНИИСБ по государственному заданию № 0574-2014-0003. Благодарим Хавинсона В.Х. за предоставленные AlaGluAspGly, AlaAspGluLeu и ООО Синтол за синтез праймеров к генам GRF.

T A Dilovarova

All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: dilovarova@yandex.ru
Timiryazevskaya st., 42, Moscow, Russia, 127550

Диловарова Татьяна Анатольевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник группы геномной модификации ФГБНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии

S V Smesova

All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: smesova.svetlana@mail.ru
Timiryazevskaya st., 42, Moscow, Russia, 127550

Смесова Cветлана Викторовна - студент РГАУ Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева; младший научный сотрудник группы геномной модификации ФГБНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии

E N Baranova

All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: greenpro2007@rambler.ru
Timiryazevskaya st., 42, Moscow, Russia, 127550

Баранова Екатерина Николаевна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клеточной биологии ФГБНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии

L I Fedoreyeva

All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: fedlara@inbox.ru
Timiryazevskaya st., 42, Moscow, Russia, 127550

Федореева Лариса Ивановна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник группы геномной модификации ФГБНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии

  • Kharchenko P.N. Problems of agro-biotechnology. FEDERAL state budgetary scientific institution “Rosinformagrotekh”, 2012. C. 1—260.
  • Czyzewicz N., Yue K, Beeckman T. Communications I. estimates in a bottle: small signalling peptide outputs during growth and development. J. exp. Biolle. 2013. No. 66. P. 5229—5243.
  • Murphy E., Smith S., De Smet I. Signalling Small peptides in Arabidopsis development: how cells communicate at a distance shot. Plant cell. 2012. No. 24. P. 3198—3217.
  • Wang G., Zhang G., Wu M. CLE Signaling peptides and cross stem with phytohormones and environmental stimuli. Science about plants by 2016. No. 6. P. 1211—1217.
  • Betsuyaku S., Sawa S.M. Yamada functions of CLE peptides in plants plant development microbe interactions. The Arabidopsis book. 2011. No. 9. P. 149.
  • Fedoreeva L.I., Dilovarov T.A., Agapkin V., Martirosyan Yu.C., Khavinson X., Kharchenko P.N., Vanyushin B.F. Short peptides regulate gene expression of exogenous CLE, KNOX1 and GRF from Nicotiana tabacum. Biochemistry. 2017. No. 82. P. 700—709.
  • Murashige T., Skoog F. Revised medium for rapid growth and bioanalysis with tobacco tissue cultures. Physiology of plantar. 1962. T. 15. No. 3. S. 473—497.
  • Zhang V., Ju. R. Molecular mechanism of stem cells in the Arabidopsis talian. Pharmakogn. Rev. 2014. No. 8(16). P. 105—112.
  • Omidbakhsfar A.M., Proust C., Fujikura U., Mueller-Roeber B. Growth-regulatory factors (CSF): a small Transcription factor family with essential functions in plant biology. Biochemistry Plant. 2015. No. 8. P. 998—1010.
  • Jimenez V.M. Participation of plant hormones and plant growth regulators under laboratory conditions somatic embryogenesis. Regulation of plant growth. 2005. T. 47. No. 2—3. P. 91—110.

Views

Abstract - 1589

PDF (Russian) - 142


Copyright (c) 2017 Dilovarova T.A., Smesova S.V., Baranova E.N., Fedoreyeva L.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.